Regulation of transient receptor potential canonical channels TRPC3 and TRPC6 in kidney diseases

Abstract

Transient receptor potential canonical (TRPC) channels are non-selective cation channels mediating cation influx into several cell types. TRPC channels have been associated with kidney diseases. We begin in Chapter 1 where we investigated the expression profile of TRPC channels in tissues from control Wistar rats and Munich Wistar Frömter (MWF) rats showing proteinuria. We used several laboratory approaches including quantitative real-time PCR, immunoblotting, and immunohistochemistry. Our findings suggest that altered TRPC expression pattern in kidney cortex is associated with kidney damage in MWF rats showing albuminuria. Recent experimental results show that activation of the calcium-sensing receptor affects TRPC expression. To the best of our knowledge, no such data are available for humans. In Chapter 2, we investigate the regulation of TRPC3 channels in patients with chronic kidney disease. Using quantitative in-cell Western assay, we compared the expression of TRPC3 channel protein in monocytes from patients with chronic kidney disease and age- and sex-matched healthy control subjects. TRPC3 channels were identified by immunoblotting and TRPC3 protein was further confirmed by mass spectrometry. This study demonstrates that reduced extracellular calcium concentration up-regulates TRPC3 channel protein expression in patients with chronic kidney disease. Because previous studies place the type I transmembrane heparan sulfate proteoglycan syndecan 4 (Sdc4) as a major modulator of signal transduction and regulation of channels, we studied the possible link between TRPC channels and Sdc4. In Chapter 3, we propose a knockout mouse model to study the regulation of TRPC channels. Sdc4 knockout (Sdc4-/-) mice showed increased glomerular filtration rate, ameliorated albuminuria under baseline conditions and, after bovine serum albumin overload, compared to wild type (Sdc4+/+) littermates. Using quantitative real-time PCR and immunoblotting, Sdc4-/- mice showed reduced TRPC6 mRNA by 79% and TRPC6 protein by 82%. Sdc4-/- mice showed an increased RhoA activity by 87% and increased phosphorylation of ezrin in glomeruli by 48%. Sdc4 knockdown in cultured podocytes reduced TRPC6 gene expression, reduced the association of TRPC6 with plasma membrane and TRPC6-mediated calcium influx and currents. Sdc4 knockdown inactivated negative regulatory protein RhoGAP by 33%, accompanied by a 41% increase in RhoA activity and increased phosphorylation of ezrin. Conversely, overexpression of Sdc4 reduced RhoA activity, increased TRPC6 protein and TRPC6-mediated calcium influx and currents. Taken together, we show that TRPC6 gene expression and function are regulated by Sdc4 via RhoA/ROCK pathway.

Transient receptor potential canonical (TRPC) Kanäle sind nicht selektive Kationen-Kanäle. Sie dienen dem Kationen-Einstrom bei verschiedenen Zelltypen. TRPC Kanäle wurden mit Nierenkrankheiten in Verbindung gebracht. Zunächst habe ich die Expression von TRPC Kanäle im Gewebe von Wistar Ratten und von Munich Wistar Frömter Ratten verglichen. Munich Wistar Frömter Ratten zeigen eine gesteigerte Proteinurie. Die Expression von TRPC Kanälen wurde mittels quantitativer real-time PCR, Immunobloting und Immunhistochemie untersucht. Meine Ergebnisse legen nahe, dass bei Munich Wistar Frömter Ratten eine veränderte TRPC-Kanal-Expression in der Niere mit einer Nierenschädigung im Sinne einer Albuminurie einhergeht. Anschließend untersuchte ich die Regulation von TRPC3 Kanälen bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung. Mittels quantitativem in-cell Western-Assay habe ich die Expression von TRPC3 Kanal-Proteinen in mononukleären Zellen von Patienten mit einer chronischen Nierenerkrankung sowie von gesunden Kontrollpersonen verglichen. TRPC3 Kanäle wurden durch Immunoblotting und auch durch Massenspektrometrie identifiziert. Ich konnte zeigen, dass eine verminderte extrazelluläre Kalziumkonzentration zu einer Steigerung der TRPC3 Kanal-Protein-Expression bei Patienten mit einer chronischer Nierenerkrankung führt. Syndecan 4, ein Heparansulfatproteoglycan stellt einen wichtigen Modulator der Signaltransduktion und bei der Regulation von Kanälen dar. Ich habe eine mögliche Verbindung zwischen TRPC Kanälen und Syndecan 4 untersucht. Syndecan 4- Knockout Mäuse (Sdc4-/-) hatten eine höhere glomeruläre Filtrationsrate und eine geringere Albuminurie, sowohl unter Baseline-Bedingungen als auch nach Stimulation mit Rinderserumalbumin jeweils im Vergleich zu den Wildtyp Mäusen (Sdc4+/+). Quantitative real-time PCR und Immunobloting zeigten bei Sdc4-/- Mäusen um 79% reduzierte TRPC6 Transkripte und um 82% reduziertes TRPC6 Kanal-Protein. Sdc4-/- Mäuse zeigten eine Steigerung der RhoA Aktivität um 87% und erhöhte Phosphorylierung von Ezrin in den Glomeruli um 48%. Sdc4 knockdown führte in kultivierten Podozyten zu einer reduzierten TRPC6 Genexpression, zu einer Verminderung von TRPC6 Kanal-Protein in der Plasmamembran und zu einer Verminderung des TRPC6-vermittelten Calcium- Einstrom und Kationen Strömen (voltage clamp). Sdc4 knockdown inaktivierte das negativ-regulatorische Protein RhoGAP um 33%. Dies war begleitet von einem 41% Anstieg der RhoA-Aktivität und von einer erhöhten Phosphorylierung von Ezrin. Andererseits führte die Überexpression von Syndecan 4 zur Verminderung der RhoA Aktivität, zur Steigerung von TRPC6 Kanal-Protein, zur Steigerung des TRPC6-vermittelten Calcium-Einstroms und von Kationen-Strömen. Zusammengenommen zeigt meine Untersuchung, dass Syndecan 4 die TRPC6 Kanal- Proteine und deren Funktionen über einen RhoA/ROCK-abhängigen Weg reguliert.