Überprüfung neuer therapeutische Strategien in Zellen des kutanen T-Zell-Lymphoms und deren Wirkung auf die Apoptoseregulation

Abstract

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are a relatively rare disease with an estimated 3-4 new cases per year per million population in Europe and yet have been classified as se-rious due to lifelong morbidity and permanent sustained impairment of quality of life. Cur-rent therapies are often inadequate or lacking durable efficacy. Signaling pathways that inducing cell death are important for both suppression of tumorigenesis and efficacy of the antitumor therapy. However, the mechanisms leading to cell death in CTCL are cur-rently poorly understood. The aim of this study was to identify new therapeutic strategies to induce apoptosis in CTCL cells and to investigate the apoptotic signaling pathways in CTCL cells at the mo-lecular level. Four CTCL cell lines (HH, HuT-78, MyLa, SeAx) were treated with different effectors and subsequently analyzed by flow cytometry to quantify apoptosis, ROS pro-duction as well as loss of mitochondrial membrane potential and for regulation of the apoptotic signaling pathways by Westernblot. In this study, three therapeutic strategies were identified. A proapoptotic effect of ingenol mebutate PEP005 was demonstrated in two of four CTCL cell lines. The mechanism was associated with PKCδ (protein kinase C-delta) activation and subsequent activation of proapoptotic caspase-3. The resistant cell lines were characterized by certain molecu-lar characteristics such as expression of p53 and p21, as well as increased expression of the antiapoptotic proteins c-FLIP and XIAP, which could thus serve as candidates for stratification of patients. BH3 (Bcl-2 homology domain 3) mimetics represented the sec-ond group of compounds studied. The investigation on Mcl-1 inhibitor S63845 showed that two out of four CTCL cell lines were highly sensitive. The two cell lines with only low sensitivity to S63845, on the other hand, were characterized by high sensitivity to ABT-263 and ABT-737, which are known as specific inhibitors of Bcl-2, Bcl-w, and Bcl-xL. The sensitivity to S63845 was found to be correlated with the decreased expression of Bcl-2 and Bcl-xL and most importantly, with the absence of Bcl-w expression. Bcl-w could therefore be used as a biomarker for sensitivity of CTCL to S63845. The third strategy was based on the indirubin derivative DKP-071, which induced apoptosis depending on ROS induction. These three studied effectors could potentially be used as new therapeutic strategies for CTCL. Further analyses are required to validate the current findings.

Die kutanen T-Zell-Lymphome (CTCL) sind mit geschätzten 3-4 Neuerkrankungen pro Jahr und einer Million Einwohner in Europa eine relativ seltene Erkrankung, die jedoch aufgrund der lebenslangen Morbidität und dauerhaft nachhaltigen Beeinträchtigung der Lebensqualität als schwerwiegend eingestuft wurde. Aktuelle Therapien sind häufig unzureichend oder haben keine dauerhafte Wirksamkeit. Signalwege, die den Zelltod induzieren, sind sowohl für die Unterdrückung der Tumorentstehung als auch für die erfolgreiche Umsetzung einer Antitumortherapie wichtig. Jedoch sind die Prozesse, die zum Zelltod beim CTCL führen, derzeit noch unzureichend verstanden. Ziel der Arbeit war es, neue Therapieansätze zur Apoptoseinduktion in CTCL-Zellen zu identifizieren und die apoptotischen Signalwege in CTCL-Zellen auf molekularer Ebene zu untersuchen. Vier CTCL-Zelllinien (HH, HuT-78, MyLa, SeAx) wurden mit verschiedenen Effektoren behandelt und anschließend mittels Durchflusszytometrie zur Quantifizierung von Apoptose, ROS Produktion sowie Verlust des mitochondrialen Membranpotentials sowie mittels Westernblot die Regulation der apoptotischen Signalwege untersucht. In dieser Arbeit konnten drei therapeutische Strategien indentifiziert werden. Eine proapoptotische Wirkung des Ingenolmebutats PEP005 wurde in zwei von vier CTCL Zelllinien nachgewiesen. Der Mechanismus war mit der Aktivierung der PKCδ (Protein Kinase C-delta) sowie der darauffolgenden Aktivierung der proapoptotischen Caspase-3 verbunden. Die resistenten Zelllinien zeichneten sich durch bestimmte molekulare Merk male wie die Expression von p53 und p21 sowie durch eine verstärkte Expression der antiapoptotischen Faktoren c-FLIP und XIAP aus, die somit als Kandidaten für eine Stratifizierung von Patienten dienen könnten. Die zweite untersuchte Substanzgruppe stellten BH3-Mimetika dar. Dies sind Inhibitoren für antiapoptotische Bcl-2-Proteine, die strukturelle Ähnlichkeit zur BH3-Domäne (Bcl-2 homology domain 3) besitzen. Die Untersuchung des Mcl-1-Inhibitors S63845 zeigte, dass zwei von vier CTCL-Zelllinien hohe Sensitivität besaßen, während die zwei Zelllinien mit geringer Sensitivität für S63845 andererseits durch eine hohe Sensitivität gegenüber den für Bcl-2, Bcl-w und Bcl-xL spezifischen Inhibitoren ABT-263 und ABT-737 charakterisiert waren. Die Sensitivität gegenüber S63845 korrelierte mit einer verminderten Expression von Bcl-2 und Bcl-xL sowie einer fehlenden Bcl-w-Expression. Bcl-w könnte da her als Biomarker für die S63845-Sensitivität des CTCLs eingesetzt werden. ie dritte Strategie beruhte auf dem Indirubin-Derivat DKP-071, die Apoptose in Abhängigkeit der ROS Produktion induzierte. Diese drei untersuchten Effektoren könnten als neue therapeutische Strategien für das CTCL genutzt werden. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die aktuellen Ergebnisse zu validieren.