Novel Small Molecules for treatment of hepatocellular cancer

Abstract

Hepatocellular carcinomas (HCC) account for more than 80% of all primary liver cancers globally, making them the fourth leading cause of cancer-related death. Significant advancements have been achieved recently in surgical, interventional, and radiotherapy for early HCC. Advanced and metastatic HCC, however, continue to lack efficient medical therapy options, therefore, new systemic therapies are desperately needed. In this study, investigating the antineoplastic and antiangiogenic mode of action of two newly synthesized tyrosine kinase inhibitors (Thio-Iva and Thio-Dam) for cutting-edge medical HCC therapy using a coordinated set of in vitro and in vivo approaches. Thio-Iva exhibited multikinase inhibitory action, with the most pronounced effects on VEGFR-2 (about 90%inhibition). Crystal violet and iCelligence were used to determine anti-proliferative effects, and Thio-Iva and Thio-Dam exhibited strong anti-proliferative effects in Huh-7 and SNU449 HCC cell lines at sub-micromolar or low micromolar IC50 values, were as follows: Thio-Iva (0.29 ± 0.18 μM and 0.53±0.32μM) and Thio-Dam (0.81±0.26μM and 1.64±0.51μM). Flow cytometry analysis demonstrated a significant cell cycle arrest in the G2/M phase, and western blot analysis revealed a similar reduction of Cyclin B1 in HCC cell lines treated with Thio-Iva and Thio-Dam. Fluorescence microscopy was used to measure the induction of reactive oxygen species (ROS) using the ROS-sensitive dye CellROX Orange. Apoptosis induction was measured with Caspase-3 activity ELISA, showing the apoptosis effects of Thio-Iva and Thio-Dam increased ROS-driven, mitochondria-associated apoptosis and caspase-3 activation. The antiangiogenic effects were investigated using tube formation experiments. The new compounds effectively inhibited the development of capillary tubes on human endothelial cells (EA. hy926) in vitro, indicating that they possess antiangiogenic properties. Finally, the antiangiogenic and antineoplastic effects of the new compounds in vivo were confirmed by performing chorioallantoic membrane assays (CAM assays). Notably, the novel compounds were more effective in reducing HCC tumour growth in vivo than the clinically relevant TK inhibitor Sorafenib. Here, this study can demonstrate that two novel tyrosine kinase inhibitors, Thio-Iva and Thio-Dam, have significant anti-tumour and anti-angiogenic properties in HCC cell lines. It was shown that these new compounds can effectively attack the cellular processes and features of HCC cells that are acquired during the carcinogenic process. Based on the findings of this study, Thio-Iva and Thio-Dam were effective in HCC cell lines, and further research is required to see whether these compounds may be employed as an alternative treatment.

Hepatozelluläre Karzinome (HCC) machen weltweit mehr als 80 % aller primären Leberkrebserkrankungen aus und sind damit die vierthäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle. Bei der chirurgischen, interventionellen und Strahlentherapie von HCC im Frühstadium wurden in letzter Zeit bedeutende Fortschritte erzielt. Für das fortgeschrittene und metastasierte HCC gibt es jedoch nach wie vor keine wirksamen medizinischen Behandlungsmöglichkeiten, weshalb neue systemische Therapien dringend erforderlich sind. In dieser Studie wird die antineoplastische und antiangiogene Wirkungsweise von zwei neu synthetisierten Tyrosinkinase-Inhibitoren (Thio-Iva und Thio-Dam) für eine innovative medizinische HCC-Therapie mit einer Reihe von koordinierten in vitro- und in vivo-Ansätzen untersucht. Thio-Iva zeigte eine multikinasehemmende Wirkung, mit den ausgeprägtesten Effekten auf VEGFR-2 (etwa 90% Hemmung). Kristallviolett und iCelligence wurden verwendet, um die antiproliferativen Effekte zu bestimmen, und Thio-Iva und Thio-Dam zeigten starke antiproliferative Effekte in den Huh-7- und SNU449-HCC-Zelllinien bei submikromolaren oder niedrigen mikromolaren IC50-Werten, die wie folgt waren: Thio-Iva (0,29 ± 0,18 μM und 0,53±0,32μM) und Thio-Dam (0,81±0,26μM und 1,64±0,51μM). Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab einen ausgeprägten Zellzyklus-Stillstand in der G2-M-Phase, und der Western Blot zeigte eine entsprechende Cyclin B1-Suppression in den HCC-Zelllinien nach der Behandlung mit Thio-Iva und Thio-Dam. Die Induktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) wurde durch Fluoreszenzmikroskopie mit dem ROS-empfindlichen Farbstoff CellROX Orange bestimmt. Die Apoptoseinduktion wurde mit dem ELISA-Test für die Caspase-3-Aktivität gemessen, der die Apoptosewirkung von Thio-Iva und Thio-Dam durch ROS-getriebene, mitochondrien-assoziierte Apoptose und Caspase-3-Aktivierung zeigte. Die antiangiogenen Wirkungen wurden in vitro in an immortalisierten humanen Endothelzellen (Ea.Hy926) - untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass die neuen Verbindungen bei der Hemmung der Bildung kapillarähnlicher Strukturen wirksam sind. Schließlich wurden die antiangiogenen und antineoplastischen Wirkungen der neuen Verbindungen in vivo durch die Durchführung von Chorioallantoismembran-Assays (CAM-Assays) bestätigt. Bemerkenswert ist, dass die neuen Verbindungen das Wachstum von HCC-Tumoren in vivo wirksamer reduzieren als der bereits zugelassene und klinisch relevante TK-Inhibitor Sorafenib. Hier können wir zeigen, dass zwei neue Tyrosinkinase-Inhibitoren, Thio-Iva und Thio-Dam, signifikante Anti-Tumor- und Anti-Angiogenese-Eigenschaften in HCC-Zellen haben. Es konnte gezeigt werden, dass diese neuen Verbindungen die zellulären Prozesse und Merkmale von HCC-Zellen, die während des karzinogenen Prozesses erworben werden und als entscheidende Kennzeichen von Krebs bekannt sind, wirksam angreifen können. Ausgehend von den Ergebnissen dieser Studie waren Thio-Iva und Thio-Dam bei HCC-Zelllinien wirksam, und es sind weitere Forschungen erforderlich, um festzustellen, ob diese Verbindungen als alternative Behandlung eingesetzt werden können.