Repositioned drugs against the MACC1-β-catenin-S100A4 axis of metastasis suppress colon cancer metastasis in a synergistic manner

Abstract

Einleitung: Metastasen sind Haupttodesursache des kolorektalen Karzinoms (KRK). Trotz kurativer Therapie entwickeln 50% der nicht-metastasierten KRK-Fälle metachro-ne Metastasen. Das Sekretom des Primärtumors könnte eine frühe Metastasierung fördern. Metastasis-associated in colon cancer-1 (MACC1) ist ein Treiber der Tumorprogression, aber seine Rolle im Tumorsekretom ist unbekannt. Hier wurde versucht durch Hemmung der MACC1-abhängigen Tumorzellmotilität die metachrone Metasta-sierung zu verhindern. Methoden: MACC1-konditioniertes Medium wurde funktionell und in seiner Peptid-Zusammensetzung analysiert. Kaplan-Meier Schätzer bewertete das KRK-Risiko anhand der RNA-Expression von MACC1 und S100A4 in Tumor- und Blutproben. Korrelation von MACC1 und S1000A4 wurde in drei Kohorten von KRK-Tumorproben analysiert. S100A4-Regulation wurde auf Promoter-, RNA- und Proteinebene gemessen. In funktionellen Versuchen wurde S100A4 mittels CRISPR-Cas9 oder mit pharmakologischen Inhibitoren unterdrückt. Proteininteraktionen wurden mit Massen-Spektrometrie und Ko-Immunopräzipitation untersucht. Wundheilungsversuche ermittelten die KRK-Zellmigration unter Gabe von Statinen (Atorvastatin, Fluvastatin, Lovastatin) und Niclosamid. Metastasen wurden modelliert durch Injektion von KRK-Zellen in die Milz von SCID bg/bg Mäusen und unter oraler Gabe von Statinen und Niclosamid monitiert. Mikrometastasen wurden anhand der Last an humaner Satelliten-DNA in tumorfrei erscheinendem Lebergewebe gemessen. Ergebnisse: MACC1 induzierte KRK-Zellmotilität und S100A4-Sekretion in das Kul-turmedium. Hohe MACC1- und S100A4-Expression im Tumorgewebe und in Patientenblut sagte ein schlechtes metastasenfreies und gesamtes Überleben voraus. MACC1 stimulierte die Promoteraktivität, die RNA- und Proteinexpression von S100A4 in Zellkultur und in Tumoren von ApcMin-Mäusen mit ektopischem MACC1. MACC1 steigerte die Motilität nur in KRK-Zellen mit intakter S100A4-Expression, aber nicht unter S100A4-Depletion. Wnt/β-Catenin-Inhibitoren unterdrückten MACC1-abhängige Hochregulation von S100A4. MACC1 interagierte mit β-Catenin und verstärkte dessen Phosphorylierung und Interaktion mit TCF4. Kombinierte Gabe von Statinen und Niclosamid unterdrückte die Motilität von KRK-Zellen. Orale Gabe von Statin und Niclosamid verhinderte nicht das Auswachsen von Metastasen, aber unterdrückte die Absiedelung von Mikrometastasen in Mauslebern.

Schlussfolgerungen: MACC1 treibt die Krebsprogression durch sekretorisches S100A4, und Überexpression beider Biomarker zeichnet Hochrisiko-KRK aus. MACC1 induziert S100A4 via Wnt/β-Catenin durch Interaktion mit β-Catenin und Stimulation seiner transkriptionellen Aktivität. Die Kombination transkriptioneller Inhibitoren von MACC1 und S100A4 unterdrücken synergistisch das metastatische Potential von KRK-Zellen in vitro und in vivo. MACC1 und S100A4 kooperieren in der KRK-Progression als Induktor und Effektor innerhalb einer MACC1-β-Catenin-S100A4-Achse der Metastasierung.

Introduction: Metastasis is the main cause of colorectal cancer CRC death. Despite curative therapy, 50% of non-metastasized CRC cases will develop metachronous metastasis. Factors secreted by the primary tumor might facilitate early metastasis into distant organs. Metastasis-associated in colon cancer-1 (MACC1) drives cancer progression, yet it’s involvement in the tumor secretome is unknown. This project aimed to tar-get MACC1-driven motility of cancer cells to prevent metachronous metastasis. Methodology: MACC1-conditioned medium was analyzed functionally and for peptide composition. CRC risk assessment employed Kaplan-Meier estimation on MACC1 and S100A4 RNA expression in patient-derived tumor and blood samples. Correlation of MACC1 and S1000A4 expression was analyzed in three cohorts of CRC tumor specimens. Regulation of S100A4 was measured with promoter reporters, and on RNA and protein level. CRISPR-Cas9 knock-out and pharmacological inhibitors were employed to inhibit S100A4 in functional assays. Protein-protein interactions were examined via Mass-spectrometry and Co-Immunoprecipitation. Wound healing experiments as-sessed CRC cell migration under statins (atorvastatin, fluvastatin or lovastatin) and niclosamide. Metastasis was modelled by injection of CRC cell into the spleen of SCID bg/bg mice and monitored non-invasively under oral administration of statins and niclosamide. Micrometastases were quantified by measuring loads of human satellite DNA in tumor-free appearing liver tissue. Results: MACC1 induced CRC cell motility and S100A4 secretion into culture medium. High MACC1 and S100A4 expression in tumor tissue and in patient blood predicted dismal metastasis-free and overall survival. MACC1 stimulated promoter activity, RNA, and protein expression of S100A4 in cell culture and in tumors of ApcMin mice with ectopic MACC1. MACC1 enhanced motility only in CRC cells with intact S100A4 expression, but not in S100A4-depleted cells. Wnt/β-catenin signaling inhibitors sup-pressed S100A4 upregulation by MACC1. MACC1 interacted with β-catenin and enforced its phosphorylation and interaction with TCF4. Combined administration of statins and niclosamide synergistically suppressed the motility of CRC cells. Oral com-binations of statin and niclosamide did not prevent metastatic outgrowth but suppressed the abundance of micrometastases in mouse liver.

Conclusion: MACC1 drives cancer progression via secretory S100A4, and combined overexpression of these biomarkers hallmarks high-risk CRC tumors. MACC1 induces S100A4 via Wnt/β-catenin by interacting with β-catenin and stimulating its transcrip-tional activity. Combination of respective transcriptional inhibitors synergistically suppress the metastatic potential of CRC cells in vitro and in vivo. MACC1 and S100A4 cooperate in CRC progression as inducer and effector within a druggable MACC1-β-catenin-S100A4 axis of metastasis.