Dissecting extrachromosomal circular DNA heterogeneity in single cells with scEC&T-seq

Abstract

Extrachromosomal DNA circularization is a common event in cancer that can occur in various forms. Many small circular DNAs, generated through DNA fragmentation processes such as DNA damage and apoptosis, exist in both normal and cancerous tissues. Other large, cancer-specific circular DNAs, commonly referred to as ecDNA, serve as potent vehicles for oncogene amplification in aggressive tumors. Extrachromosomal elements undergo random segregation during mitosis, facilitating rapid intercellular heterogeneity and enabling tumors to evolve and evade therapy at an accelerated pace. A better understanding of circular DNA dynamics and their impact on intercellular hetero-geneity in cancer is crucial. Therefore, there is a need for novel single-cell methodologies that enable the profiling of all types of circular DNAs in single cancer cells. In this doctoral thesis, we introduce scEC&T-seq (single-cell extrachromosomal circular DNA and transcriptome sequencing), a new single-cell method that enables the simultaneous detection of circular DNA and full-length mRNA from the same single cell. Applying scEC&T-seq to neuroblastoma cell lines and primary tumors, we characterized hundreds of circular DNA elements per single cell. While large, ecDNAs were recurrently identified in most cancer cells, small circular DNAs were mostly private and not shared between individual cells, indicating differences in their selection and propagation. scEC&T-seq successfully recapitulated the complexity of ecDNA structures in single cells and characterized intercellular differences in ecDNA structure. This enabled the inference of ecDNA structural dynamics over time in primary neuroblastoma tumors. Additionally, the parallel interrogation of ecDNA and gene expression data revealed that intercellular differences in ecDNA content drive oncogene expression differences in single cells. We anticipate that applying scEC&T-seq to samples from different biological contexts will unravel new insights into the role of both large and small extrachromosomal circular DNAs in cancer and beyond.

Extrachromosomale DNA-Zirkularisierung ist ein häufiges Ereignis bei Krebs, das in verschiedenen Formen auftreten kann. Viele kleine zirkuläre DNAs, die durch DNA-Fragmentierungsprozesse entstehen, existieren sowohl in gesundem Gewebe als auch in bösartigem Gewebe. Andere große, tumorspezifische zirkuläre DNAs, allgemein als ecDNA bezeichnet, dienen als effektives Mittel zur Verstärkung von Onkogenen in aggressiven Tumoren. Aufgrund ihres Fehlens von Zentromeren segregieren sich zirkuläre DNAs zufällig auf Tochterzellen während der Mitose. Dies kann eine schnelle interzelluläre Heterogenität fördern, wodurch Tumoren die Fähigkeit erhalten, sich schnell zu entwickeln und der Therapie zu entkommen. Das Verständnis der Dynamik zirkulärer DNA und ihres Beitrags zur interzellulären Heterogenität bei Krebs ist jedoch nach wie vor von großer Bedeutung, da Methoden für eine unvoreingenommene Charakterisierung sowohl großer als auch kleiner zirkulärer DNAs in einzelnen Zellen fehlen. In diesem Projekt haben wir uns zum Ziel gesetzt, scEC&T-seq (single-cell extrachromosomal circular DNA and transcriptomic sequencing) zu etablieren, eine Methode für die parallele Detektion zirkulärer DNAs und vollständiger mRNA in einzelnen Zellen. Durch Anwendung von scEC&T-seq auf Neuroblastom-Zelllinien und primäre Tumore haben wir hunderte zirkuläre DNA-Elemente pro Einzelzelle charakterisiert. Während große, Onkogene enthaltende ecDNAs wiederholt in den meisten Krebszellen identifiziert wurden, waren kleine zirkuläre DNAs hauptsächlich auf einzelne Zellen beschränkt, was auf Unterschiede in ihrer Auswahl und Vermehrung hinweist. scEC&T-seq konnte erfolgreich die komplexe Struktur von ecDNAs in einzelnen Zellen wiedergeben, und lieferte ausreichende Details, um Unterschiede in der ecDNA-Struktur zwischen den Zellen zu charakterisieren. Dies ermöglichte die Ableitung von ecDNA-Strukturdynamiken im Laufe der Zeit in primären Tumoren. Zusätzlich offenbarte die gleichzeitige Untersuchung von ecDNA- und Genexpressionsdaten, dass interzelluläre Unterschiede im ecDNA-Gehalt Unterschiede in der Onkogenexpression in einzelnen Zellen beeinflussen. Wir gehen davon aus, dass die Anwendung von scEC&T-seq auf Proben aus verschiedenen biologischen Kontexten neue Erkenntnisse über die Rolle großer und kleiner extrachromosomaler zirkulärer DNAs bei Krebs und darüber hinaus ermöglichen wird.