Biokompatibilität von in vitro gezüchteten osteochondralen Biphasen in der Nacktmaus

Abstract

Ziel dieser Arbeit war, mit Hilfe des Tissue Engineerings ein osteochondrales, mit Chondrozyten beladenes Implantat herzustellen und dessen biologischen Eigenschaften, die Stabilität des Zell-Biomaterial-Verbundes und die Synthese knorpeltypischer extrazellulärer Matrix in einem geeigneten Modell zu untersuchen. Dazu wurde ein biphasisches Implantat entwickelt, das aus einem resorbierbaren, bioaktivem Knochenzement und einem resorbierbaren Polymervlies bestand. Es wurden Chondrozyten aus Gelenken von Rindern gewonnen und in Monolayerkultur amplifiziert. Nach einer maximalen Zahl von drei Passagen wurden die Chondrozyten in einer Fibrinsuspension in das Vlies des biphasischen Implantats eingebracht und für zwei Wochen in einer Perfusionskultur gehalten. Anschließend erfolgte die subkutane Verpflanzung der 24 Implantate in Nacktmäuse (CD1 nu/nu). Um einen möglichen Vorteil des Polymervlieses als Trägermaterial für die Knorpelquälität zu nachzuweisen, wurden als Kontrollen ebenfalls 24 Implantate ohne Polymervlies mit Chondrozyten beimpft und entsprechend implantiert. Die Implantate wurden nach 7, 14, 28 und 84 Tagen mit umgebendem Gewebe entfernt und lichtmikroskopisch und histomorphometrisch untersucht. Nach 7 und 14 Tagen fand sich in der Mehrzahl kein Knorpel und die Ausbildung von extrazellulärer Matrix war gering. Nach 28 und 84 Tagen war überwiegend Faserknorpel zu erkennen und es wurde vermehrt die für den Knorpel typische Metachromasie sichtbar. Die Kontrollgruppe zeigte bereits nach 7 Tagen Faserknorpel, die Morphologie der Chondrozyten blieb aber über die Liegezeiten unverändert, genauso wie die Ausbildung von extrazellulärer Matrix. Die Dicke der Knorpelschicht war stets größer als in der Kontrollgruppe, allerdings war der Unterschied nicht signifikant. Ebenfalls nicht signifikant war das Aufweisen der glätteren Knorpeloberfläche über alle Liegezeiten in der Kontrollgruppe. In beiden Gruppen wurde in der Umgebung des Implantatgebietes eine fibrozytäre Abkapselung des Implantates beobachtet, immunologische Reaktionen auf die implantierten Zellen waren jedoch selten und nahmen mit der Liegedauer ab. Der Calciumphosphatzement zeigte nach 84 Tagen in beiden Gruppen eine durch Degradation entstandene poröse Oberfläche und daran haftende matrixbildende Zellen. Die Verankerung des Vlieses im Zement war teilweise unvollständig und es waren Zementbruchstücke losgelöst. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es mit Hilfe des Tissue Engineering möglich ist, ein künstliches und biokompatibles Implantat für die Rekonstruktion osteochondraler Gelenkdefekte herzustellen. Die Präparate mit Vlies wiesen geringe Vorteile in der Knorpeldicke, jedoch keine Vorteile in den anderen untersuchten Parametern auf. Daher bedarf es weiterer Anstrengungen, um das Zusammenspiel der einzelnen Materialien zu verbessern und in neuen Ansätzen die komplizierte Architektur des hyalinen Gelenkknorpels zu erreichen.

The aim of this study was to build osteochondrale with chondrocytes loaded implants and to test its biological characterisms, the stabilityof the cell- biomaterial-compound and to explore the synthesis of specific extracellurar matrix in a proper model. Therefore, we created a biphasic implant, consisting of a resorbable, bioactive bone-cement and polymer-fleece. Chondroytes prepared from bovine joints were transferred in monolayer-culture. After three cycles, chondrocytes were in fibrine-suspension in the fleece of prebuild implants and maintained for two weeks in perfusion-culture. Afterwards, we implanted 24 constructs subcutaneously in nudemice (CD1 nu/nu). To show a possible advantage of polymer-fleece as a carrier for chondrocytes, we implanted 24 implants without the fleece only seeded with chondrocytes. The implants were removed after 7, 14, 28, and 84 days with the surrounding tissue and analyzed microscopically and histomorphologically. After 7 and 14 days we didn't found cartilage in the mojority and the appearance of extracellular- matrix was low. After 28 and 84 days we saw much fiber-cartilage and more of typical metachromasy. The control-group showed after 7 days fiber-cartilage, but morphology didn't change during the whole time, just as growth of extracellular matrix. The thickness of the cartilage layer was always higher than in the control-group even though it was not significant. Furthermore, there was no significant difference between smoothness of the surface. In both groups we found fibrocytes containing layer in the surrounding of the implant, immunologic reactions were not seen as expected. The calciumphosphate cement showed degradation after 84 days with a porous surface and interacting matrix producing cells. Anchoring of the fleece was in some cases insufficient and parts of the cement were detached. In this study we showed, that it is possible to create an artificial biocompatible implant for reconstruction of osteochondral defects. Implants with fleece had advantages with thickness of cartilage layer but not with other proofed parameters. That's why more investigation and research needed to improve interaction of the different biomaterials and engineering of the complicated architecture of hyaline cartilage in new attempts.