Die Serotonylierung von Transkriptionsfaktoren als Mechanismus in der Leberregeneration und der Pathogenese des Alkoholismus

Abstract

Studien an verschiedenen humanen ethnischen Gruppen bringen intronische Polymorphismen der peripheren Form der Tryptophan‐Hydroxylase (TPH1) direkt mit einem gesteigerten Risiko für die Entwicklung eines Alkoholismus und außerdem mit einem frühen Eintrittsalter in die Alkoholabhängigkeit in Zusammenhang. Zusätzlich gibt es humane und murine Genkopplungsstudien, die eine erhöhte Ethanolpräferenz mit den Chromosomenabschnitten in Verbindung bringen, auf denen jeweils TPH1 (11p15) und Tph1 (7qB4) liegen. Um diese Beobachtung zu verifizieren und deren molekularen Hintergrund aufzuklären, wurden Tph1‐/‐‐Mäusen ohne und nach vorheriger Konditionierung Ethanollösungen unterschiedlicher Konzentrationen zur Wahl angeboten und die Flüssigkeitsaufnahme mit der von Tph1+/+‐Mäusen mit ebenfalls homogen gemischtem genetischen Hintergrund verglichen. Tph1‐/‐‐Tiere nahmen dabei von Ethanollösungen aller Konzentrationen signifikant mehr auf. Die freiwillige Ethanolaufnahme von Tph1+/‐‐Tieren mit homogen gemischten genetischen Hintergrund nach Präkondtionierung lag ebenfalls signifikant über der von Tph1+/+‐Tieren und verdeutlicht die Relevanz des Gendefekts als Ursache des beobachteten Phänotyps. Die gesteigerte Ethanolaufnahme von Tph1‐/‐‐Tieren, die über elf Generationen auf dem Inzuchtstamm C57BL/6J zur Hybridlinie rückgekreuzt waren, konnte über die Wiederherstellung des peripheren Serotonin‐Pools mittels Supplementierung mit 5‐Hydroxytryptophan (5‐HTP) auf das Niveau der Tph1+/+‐Tiere abgesenkt werden. Mittels Überprüfung genetischer Variationstypen über die Analyse veränderter Restriktionsendonukleaseschnittstellen oder Sequenzierung von Einzelnukleotidpolymorphismen konnte gezeigt werden, dass Tph1‐/‐‐Tiere der elften Rückkreuzung bis 6 kb downstream und 308 kb upstream von Tph1 auf Chromosom 7 den C57BL/6J‐ und dazwischen den 129/SvEvBrd‐Haplotyp aufweisen. Eine Hochdurchsatz‐Sequenzierung des Lebertranskriptoms beider Genotypen mit einem SOLiD4‐System zeigte eine Erhöhung der Aldh2‐Expression in Tph1‐/‐‐Tieren, die aufgrund des verbesserten Ethanolabbaus den erhöhten Konsum dieses Genotyps erklären könnte. Diese erhöhte Expression konnte mittels qPCR verifiziert werden. Weiterhin zeigte sich eine Fehlregulation von insgesamt 1111 Genen, unter denen zahlreiche Leberproliferations‐assoziierte Gene zu finden waren. Dieser Befund bekräftigt eine Studie, die in Tph1‐/‐‐Tieren eine gestörte Leberregeneration nachweist. Die Betrachtung unterschiedlicher serologisch‐klinischer leberrelevanter Parameter beider Genotypen im Anschluss an den präkonditionierten Ethanoltrinkanordnung ergab keine Verstärkung der bereits vorhandenen Leberfunktionsstörung der Tph1‐/‐‐Tiere. Auch die Behandlung verschiedener hepatischer Zelllinien mit unterschiedlichen biogenen Monoaminen oder Ethanol ergab keinen eindeutigen Einfluss auf die Proliferationsrate, die anhand der mitochondrialen Aktivität und der DNA‐Menge quantifiziert wurde. Um zu untersuchen, ob die differentielle Genexpression in der Leber der Tph1+/+‐ und Tph1‐/‐‐Mäuse auf eine Serotonylierung von Transkriptionsfaktoren (TF) zurückzuführen sei, welche analog zu der Modifikation von GTPasen eine physiologsiche Funktion ausüben könnte, wurden verschiedene TF in vitro exemplarisch monoaminyliert und mittels EMSA‐ und Affinitätsexperimenten untersucht. Es zeigte sich neben der Modifikation aller untersuchter TF, dass eine Monoaminylierung inhibitorisch z.B. auf die Bindung von BRN2 an seine Zielsequenz wirkt und die Interaktion von drei TF zu dem Polyglutamin‐bindenden Protein 1, das als Suppressor der Aktivität des TF BRN2 bekannt ist, durch die Modifikation unabhängig von der Länge des Polyglutaminabschnitts verstärkt wird. Unabhängig vom zugrunde liegenden molekularen Mechanismus für den erhöhten freiwilligen Ethanolkonsum und die Leberfunktionsstörung der Tph1‐/‐‐Mäuse, scheint die Verabreichung von 5‐HTP ein lohnenswerter, untersuchungswürdiger, neuer Therapieansatz bei der Suchttherapie und einer verbesserten Leberregeneration von Alkoholikern mit Polymorphismen in TPH1 zu sein.

Intronic polymorphisms of the peripheral isoform of tryptophan hydroxylase (TPH1) are associated with the development of alcoholism and even with the age of onset of alcoholism related behaviour in different human ethnic groups. Furthermore, genetic linkage studies in human and mice have shown a relation of an increased voluntary ethanol intake to the chromosomal section harbouring TPH1 (11p15) and accordingly Tph1 (7qB4). To clarify the role of TPH1 in the context of voluntary ethanol intake behaviour and the molecular background of this association Tph1+/+ and Tph1‐/‐ mice with homogenic genetic background were subjected to a two‐bottle choice paradigm avoidance test with and without prior conditioning to ethanol. Using increasing concentrations of alcoholic solutions Tph1‐/‐ mice had a higher intake of all applied concentrations compared to the wildtype. With prior conditioning Tph1+/‐ mice with homogenic genetic background had a significant higher intake of ethanol as well, emphasizing the gene defect as the reason for the seen phenotype. Through administration of the serotonin precursor 5‐hydroxytryptophan (5‐HTP) Tph1‐/‐ mice (backcrossed to C57BL/6J, 11th generation) exhibit a voluntary ethanol intake comparable to the Tph1+/+ (C57BL/6J) mice intake. The genetic background of the backcrossed Tph1‐/‐ mice on chromosome 7 was analyzed by utilizing altered restriction endonuclease sites and sequencing analysis of single nucleotide polymorphisms. The mice showed the genotype of the strain 129/SvEvBrd in between 6 kb downstream and 308 kb upstream of Tph1 and the C57BL/6J genotype outside of this section. The high‐throughput sequencing of the liver transcriptome of both genotypes using the SOLiD4 technology exhibited an increase in the gene expression of Aldh2 in the Tph1‐/‐ mice. The enhanced gene expression could be verified using qPCR and might be the main reason for the increased voluntary ethanol intake. Additionally, the liver of the Tph1‐/‐ mice displayed an altered gene expression of 1111 genes altogether, of which several genes are associated to hepatocyte proliferation. This finding confirms a former study showing a disturbed liver regeneration in Tph1‐/‐ mice. The serological‐clinical liver‐related parameters were taken subsequent to the preconditioned avoidance test, but offered no enhancement of the existing disturbance of liver function in Tph1‐/‐ mice. Moreover, hepatic cell lines were treated with different biogenic monoamines and ethanol and the proliferation rate quantified on the basis of mitochondrial activity and the amount of DNA. None of the treatments revealed an explicit influence on hepatocyte proliferation. Knowing that the serotonylation of small GTPases has functional influence on the activitiy of this enzymes, different transcription factors (TF) were analyzed in vitro for the ability to be modified with biogenic monoamines by transglutaminase 2. Subsequently, the functional influence of the modification was analyzed using EMSA and pull‐down experiments. All investigated TF were modified in vitro and the modification e.g. inhibited the binding of BRN2 to its recognition site. Furthermore, the interaction of three monoaminylated TF with the polyglutamine‐binding protein 1 (PQBP1) increased length‐independently. PQBP1 is known to act as a suppressor in BRN2‐mediated transcriptional activation in the context of two different gene promotors. Independent from the underlying molecular mechanism of the voluntary higher intake of ethanol and the disturbed liver regeneration in Tph1‐/‐ mice, the administration of 5‐HTP could be a new therapy approach that is worthy of detailed examination. In alcoholic patients with polymorphisms in TPH1, 5‐HTP could improve the therapy of the addiction itself and also of the alcohol‐related liver damages.