In-vitro Untersuchungen des zytotoxischen und gentoxischen Potentials von humanen Magensäften als Grundlage der Krebsentstehung des oberen Gastrointestinaltraktes

Abstract

Epidemiologische Studien konnten eine Schädigung durch Magensaft (MS) in Form von gastro- und extraösophagealem Reflux als unabhängigen Risikofaktor für die Entstehung des Larynxkarzinoms sowie des Adenokarzinoms des Ösophagus identifizieren. Anhand der derzeitigen Studienlage jedoch bleibt unklar, welcher Schädigungsmechanismus hierbei zum Tragen kommt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es anhand von in-vitro Testsystemen pH-Wert unabhängig sowohl das gentoxische als auch das zytotoxische Potential des MS zu untersuchen. Gastroskopisch gewonnene MS-Proben von 5 gesunden Patienten (MS1-5) und 0,1 N Salzsäure (HCl) in den Konzentrationen 1:5, 1:10, 1:20 und 1:40 wurden in 5 Tests auf Zytotxizität (Propidiumjodidtest [PI], Mitochondrienmembranpotentialtest [MMP], Annexintest [AT], CDD+-ELISA, Caspasetest[CT]) geprüft sowie zwischen Apoptose und Nekrose differenziert (PI, MMP, AT). Die Belastungszeit betrug beim PI 24h, beim MMP 24 und 48h, bei den übrigen Testsystemen 2 bzw. 3h. Die Gentoxizität von MS und HCl wurde mittels Mikrokern(MK)-Test überprüft. Die MK-Rate der HCl wurde über 8d Belastung untersucht. Die Belastung mit den 5 MS erfolgte über 24h. Aus den Zytotoxizitätstests resultieren Verdachtsmomente einer Apoptoseratensteigerung durch MS (AT, CDD+-ELISA), ohne einen entsprechenden Einfluss auf die Nekrose auszuüben. Im CT war dieses Ergebnis (Konzentration 1:10) signifikant (p=0,044). Der Effekt ist konzentrationsabhängig, da eine höhere Konzentration in einer stärker ausgeprägten Apoptose resultiert (AT p=0,042; CT p=0,012). Nach Langzeitbelastung mit MS resultieren keine signifikanten Ergebnisse. Nach Kurzzeitbelastung mit HCl resultieren Verdachtsmomente einer gesteigerten Apoptose (AT, CT) nicht jedoch der Nekrose. Dieses Ergebnis war im CDD+-ELISA in den Konzentrationen 1:5 (p=0,002) und 1:10 (p=0,041) signifikant. Nach Langzeitbelastung und hinsichtlich der Konzentrationsabhängigkeit resultierten hier keine signifikanten Ergebnisse. In der Gentoxizitätsprüfung nach 24h zeigen die MS signifikant inhomogene (MS2 versus MS1 p=0,016, MS4 p=0,045, MS5 p=0,027) und zum Teil gesteigerte MK-Raten. Signifikanz gegenüber der Negativkontrolle war nicht nachzuweisen. Die Gentoxizitätsprüfung der HCl zeigt eine belastungszeitabhängige (p=0,001) Steigerung der MK-Rate ab dem 2. Tag mit einem Maximum nach 5d. Hieraus resultiert ein entsprechendes Verdachtsmoment der Gentoxizität. Trotz der geringen Probenzahl konnten wir eine konzentrationsabhängige Apoptoseinduktion nach Kurzzeitbelastung nachweisen. Hinsichtlich der Langzeitbelastung bestehen starke Verdachtsmomente einer Apoptose- und Nekroseinduktion sowie einer belastungszeitabhängig gesteigerten direkten Gentoxizität. Anhand der Ergebnisse wird es möglich, größer angelegte Studien zu planen sowie in naher Zukunft diagnostische, FACS-basierte Routineverfahren zur individuellen Risikoabschätzung der Krebsentstehung im oberen Gastrointestinaltrakt zu entwickeln.

Epidemiologic studies were able to identify gastro- and extraesophageal associated gastric juice (GJ) as an independent risk factor for development of a larynx carcinoma and an adenocarcinoma of the esophagus. Recent studies were unable to detect the underlying mechanism of damage. Aim of the current study was to research the direct and pH-independent cytotoxic and genetoxic potential of GJ employing different in-vitro tests. GJ-samples derived from gastroskopy of 5 healthy patients (GJ1-5) and 0.1N hydrochloric acid (HCl) in concentrations 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 were tested for cytotoxic effects (propidium iodide test [PI], mitochondrial membrane potential test [MMP], annexine test [AT], CDD+-ELISA, caspase assay [CA]). Separate effects on apoptosis and necrosis were recorded applying PI, MMP, AT. Exposure time was 24h (PI, MMP) and 48h (MMP) as well as 2 to 3h in the other tests. Genetoxic effects of GJ and HCl were researched employing micronucleus (MN) test. MN ratio was recorded for 8d for HCl and for 24h for the 5 GJ. Suspicious facts regarding a GJ caused increase of apoptosis without influence on necrosis result from tests for cytotoxicity(AT, CDD+-ELISA). In CA this result was significant in concentration 1:10 (p=0.044). The effect was dependent on concentration because of a higher apoptosis ratio exposing higher concentrated dilutions (AT p=0.042; CT p=0.012). No significance could be observed after long term exposure. Short term exposure with HCl resulted in suspicious facts regarding an increase of apoptosis but not necrosis (AT, CA). According to this, significance could be observed for concentrations 1:5 (p=0.002) and 1:10 (p=0.041) in CDD+-ELISA. Exposure time and dependence on concentration were not significant for HCl. Genetoxicity test results for GJ were inhomogenous (GJ2 versus GJ1 p=0.016, GJ4 p=0.045, GJ5 p=0.027) with partially increased MN rates. No significance could be recognized against the negative control. From day 2 on, genetoxicity tests of HCl resulted in a time dependent (p=0.001) increase of the MN rate with a maximum at day 5. A suspicious fact of genetoxicity results from this. Despite the low sample number, we were able to show a concentration dependent induction of apoptosis after short time exposure. Suspicious facts derive from long time exposure tests regarding an induction of necrosis and apoptosis as well as an exposure time dependent increase of genetoxicity. Following this, larger follow-up studies can be planned. Development of future FACS-based routine diagnostic tools for individual upper gastrointestinal cancer risk evaluation will be possible.