Untersuchung der Genexpression des G-Protein gekoppelten Rezeptors Lgr5 beim kolorektalen Karzinom

Abstract

Einleitung Dem transmembranären G-Protein gekoppelten Rezeptor Lgr5 wird eine bedeutende Rolle im Rahmen der Karzinogenese des kolorektalen Karzinoms (CRC) zugesprochen. Insbesondere die Überexpression des Rezeptors in malignem Tumorgewebe verschiedener Entitäten macht ihn zu einer potentiellen Zielstruktur für neue molekulare Therapieansätze. Methodik Mittels Real-Time PCR (RTQ-PCR), Western Blot Analyse (WB) und Immunhistochemie (IHC) soll die Expression von Lgr5 an Tumorgewebe von humanen kolorektalen Karzinomen (T) und korrespondierendem Normalgewebe (N) untersucht und die Expressionswerte anhand von klinisch-pathologischen Parametern, wie dem Tumorstadium und der Tumorlokalisation, analysiert werden. Dies erfolgte an Gewebe von jeweils 20 Patienten, die wegen eines kolorektalen Karzinoms operiert wurden. RTQ-PCR und WB wurde an Gewebe vom gleichen Patientenkollektiv durchgeführt, für die IHC wurde aus Gründen der Verfügbarkeit ein weiteres Kollektiv von Patienten mit einem CRC verwendet. Ergebnisse Es konnte eine signifikante Überexpression des Lgr5 Rezeptors auf RNA- und Proteinebene im kolorektalen Tumorgewebe vs. Normalgewebe (T vs. N) nachgewiesen werden (ct-Mittelwerte T 20,13; N 1,63; mittlere WB-Bandenintensität T 73,38; N 25,96; p=0.00). Die Genexpressionsanalyse in klinisch pathologisch definierten Subgruppen zeigte in der RTQ-PCR hinsichtlich des Gradings eine erhöhte relative Expression des Lgr5 Rezeptors im Tumorgewebe bei den High-Grade Karzinomen, verglichen mit den besser differenzierten CRC der low-grade Gruppe (ct-Mittelwert T/N low- grade: 14,45; high grade: 20,97; p=0,5). Bei der Lokalisation der CRC zeigte sich im Expressionsverhältnis in der RTQ-PCR T vs. N kein Unterschied zwischen den proximal gelegenen vs. den distal gelegenen Tumoren (ct-Mittelwert T/N proximal 18,13; distal 17,90; p=0,97). Die UICC Stadien III und IV wiesen höhere Werte im Verhältnis T/N als die Stadien I und II (ct-Mittelwert T/N UICC III und IV 21,56; UICC I und II 14,5; p=0,48). Eine statistische Signifikanz ließ sich jedoch bezüglich der untersuchten Subgruppen nicht nachweisen. Anders als in den Ergebnissen der RTQ-PCR auf RNA-Ebene, zeigte die WB auf Proteinebene bei den high-grade Karzinomen ein niedrigeres Verhältnis von T/N als die low-grade Karzinome (mittlere Bandenintensität T/N high-grade 4,26; low-grade 14,35; p=0,55). Die UICC Stadien III und IV wiesen dagegen ein niedrigeres Verhältnis auf, als die Stadien I und II (mittlere Bandenintensität T/N UICC III und IV 6,07; UICC I und II 11,53; p=0,48). Ein Zusammenhang zwischen dem Grad der Lgr5 Expression und den mit einer schlechteren Prognose einhergehenden High-Grade Karzinomen und den fortgeschrittenen Tumorstadien UICC III und IV ist demnach nur auf RNA-Ebene in der RTQ-PCR zu vermuten, eine statistische Signifikanz besteht jedoch nicht. Auch in der IHC ließ sich eine signifikant höhere Intensität des Tumorgewebes und damit eine stärkere Expression des Rezeptors nachweisen (Intensitäts-Mittelwert T 2,29; Normal 1,48; p=0,0). Eine intensivere Färbung, und damit einen höheren Gehalt an Lgr5-Protein wiesen die UICC Stadien III und IV (Intensitäts-Mittelwert T/N UICC III und IV 2; UICC I und II 1,44; p=0,096) sowie die Gruppe der High-Grade Karzinome (Intensitäts-Mittelwert T/N high- grade 1,95; low-grade 1,55; p=0,17) auf. Der postulierte Zusammenhang zwischen einer hohen Lgr5 Expression auf RNA-Ebene und dem Tumorfortschritt, beziehungsweise dem Differenzierungsgrad, wird demnach durch die Ergebnisse in der IHC untermauert. Schlussfolgerung Die Überexpression des Rezeptors in Tumorzellen und insbesondere das vermehrte Auftreten des Rezeptors in der RTQ- PCR und IHC in fortgeschrittenen und niedrig differenzierten Tumoren lassen eine Rolle von Lgr5 im Rahmen der Karzinogenese der CRC vermuten. Die vorliegende Arbeit liefert demnach durch die weitere Charakterisierung von Lgr5 einen zusätzlichen Baustein für das grundlegende Verständnis von Karzinogenese des CRC.

Introduction The transmembrane G-Protein coupled Receptor Lgr5 is told to play a decisive role in carcinogenesis of colorectal cancer (CRC). Especially the overexpression of the receptor in different malignant tissue makes him a promising target structure for novel molecular therapies. Methods The expression of Lgr5 is analyzed by real-time PCR (RTQ-PCR), western blotting analysis (WB) and immunohistological staining (IHC) of colorectal cancer- tissue (T) and corresponding normal-tissue (N). The received results are then compared, according to clinical parameters, such as progress and localisation of the tumor. This was performed with tissue of 20 patients who underwent surgery of colorectal cancer. For RTQ-PCR and WB the tissue was from the same patient population, whereas IHC-tissue samples, dued to limited availability, were from a different group. Results A significant overexpression of the Lgr5 receptor could be detected in CRC tumor tissue vs normal tissue (mean cycle threshold T 20,13; N 1,63; mean WB intensity T 73,38; N 25,96; p=0.00). In gene expression profiling, according to clinical-pathological parameters, the RTQ-PCR showed an increased mean T/N ratio in high-grade-carcinomas (mean cycle threshold T/N low-grade: 14,45; high grade: 20,97; p=0,5). The proximal located tumors showed in the T/N-ratio no difference, compared to the distal ones (mean cycle threshold T/N proximal 18,13; distal 17,90; p=0,97). Stages UICC III and IV revealed a higher mean T/N ratio, than stages I and II (mean cycle threshold T/N UICC III and IV 21,56; UICC I and II 14,5; p=0,48). The RTQ-PCR results according to clinical-pathological parameters showed no statistical significance. Different to the RTQ-PCR results, the high grade carcinomas revealed in western blotting analysis an increased T/N value of CRC tissue (mean WB Intensity T/N high-grade 4,26; low-grade 14,35; p=0,55). Moreover the UICC stages III and IV comprised a lower T/N value, compared to the stages I and II (mean WB intensity T/N UICC III und IV 6,07; UICC I und II 11,53; p=0,48). A connection between higher Lgr5 expression and tumors with poor prognosis, such as high-grade carcinomas and UICC stages III and IV can be assumed only on RNA-Level in RTQ-PCR, although these results had again no statistical significance. IHC revealed as well a significant overexpression of the Lgr5 receptor in CRC tissue, compared to adjacent normal colon mucosa (mean intensity IHC T 2,29; Normal 1,48; p=0,0). A higher intensitiy in immunhistological staining and thus with a higher level of Lgr5-protein, appeared the UICC stages III and IV (mean intensity IHC T/N UICC III und IV 2; UICC I und II 1,44; p=0,096) and the group of high-grade carcinomas (mean intensity T/N high-grade 1,95; low-grade 1,55; p=0,17). The supposed correlation between tumor progression and the level of differentiation is therefore underlined by the results of IHC. Conclusion Overexpression of Lgr5 in CRC and especially in advanced and less differentiated tumors indicates that Lgr5 plays an important role in carcinogenesis of CRC. The results of this work provide therefore a further component to a deeper understanding of carcinogenesis of CRC.