Neue Mechanismen der Regulation von Conductin im Wnt/beta-Catenin-Signalweg

Abstract

## Zusammenfassung

Der evolutionär stark konservierte Wnt/b-Catenin-Signaltransduktionsweg reguliert eine Vielzahl essenzieller biologischer Prozesse. Aberrante Aktivierung des Signalwegs führt zur Entstehung von Tumoren. Das zentrale Effektormolekül b-Catenin wird daher streng durch Proteolyse reguliert. Den kontinuierlichen proteosomalen Abbau und die dafür notwendige Phosphorylierung von b-Catenin gewährleistet ein zytoplasmatischer Multiproteinkomplex, dessen Rückgrat von den Gerüstproteinen Conductin oder Axin gebildet wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems neue Interaktionspartner von Conductin als potentielle b-Catenin-Regulatoren identifiziert und deren Wirkmechanismen charakterisiert.

Zunächst wurde der Einfluss von Conductin auf die Signalaktivität von b-Catenin untersucht. Conductin konnte in unserer Arbeitsgruppe neu identifiziert werden, und der erste Abschnitt der vorliegenden Arbeit ist Teil der von Behrens et al. (1998), durchgeführten funktionellen Charakterisierung. Dazu wurde ein Testsystem auf Basis eines synthetischen Wnt-Zielgens etabliert und damit die Funktion Conductins als negativer Regulator des Wnt/b-Catenin- Signalwegs nachgewiesen. Weiterhin wurde die Domänenstruktur Conductins in diesem System analysiert.

Mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems konnte I-mf a als Bindungspartner von Conductin isoliert werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass I-mf a auch mit dem GSK3b-Inhibitor Frat-1 interagiert. I-mf a moduliert die Kompetition von Conductin und Frat-1 um die Kinase GSK3b. Dabei unterstützt I-mf a den Verbleib der Kinase an Conductin und behindert den kompetitiven Angriff von Frat-1 auf die Conductin-gebundene GSK3b. Die Verdrängung von GSK3b aus dem Conductin-Komplex durch Frat-1, aber auch durch Dishevelled, wird als ein Schlüssel-Mechanismus zur Aktivierung b-Catenins angesehen. Die Befunde dieses ersten Teils etablieren eine neue Möglichkeit zur Feinregulation eines solchen Verdrängungsmechanismus.

Mit Diversin konnte in unserer Arbeitsgruppe ein weiterer Bindungspartner von Conductin identifiziert werden (Schwarz-Romond et al., 2002). Diversin ist in der Lage, die Frat-1-vermittelte Aktivierung des b-Catenin-Signals Conductin- abhängig zu potenzieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung von ternären Komplexen aus Diversin, Conductin und GSK3b für diesen Synergieeffekt essenziell ist. Grundlage dieser ternären Komplexe, und damit auch die der Synergie von Diversin und Frat-1, bildet die Di- oder Oligomerisierung von Conductin. Über diese Dimerisierungsfunktion hinaus ist die DIX-Domäne von Conductin für das Zustandekommen der ternären Komplexe und der Synergie von Bedeutung. Die Ergebnisse deuten auf einen neuen Mechanismus der Frat-1-Regulation im Wnt-Signalweg hin: Diversin ermöglicht eine optimale Konfiguration des Conductin-Komplexes für die Frat-1-vermittelte Verdrängung von GSK3b und fügt so dem Wnt-Signalweg eine neue Ebene der regulativen Einflussnahme durch laterale Signale wie Frat-1 hinzu.

## Abstract

The evolutionary conserved Wnt/b-catenin signalling pathway regulates a variety of biological processes. Abberant activation of the pathway for instance leads to tumourigenesis. Therefore, the abundance of the central effector molecule b-catenin is tightly controlled by proteasomal degradation. The N-terminal phosphorylation of b-catenin that initiates its turnover is achieved in a cytoplasmic multiprotein complex. The scaffold of this so-called degradation complex is provided by conductin or its homologue axin, both of which are essential for efficient b-catenin degradation. Using a yeast-2-hybrid approach, this study aims to identify novel conductin interacting proteins and to characterize their regulatory impact on the Wnt signalling pathway.

Initial experiments focused on the impact of conductin on the signalling activity of b-catenin. Conductin was identified in our group, and the first part of this study is part of the functional characterization by Behrens et al. (1998). A synthetic reportergene-assay was established and provides evidence for conductins role as a negative regulator of the Wnt/b-catenin signalling pathway. Using this assay, the functional aspects of the domain structure of conductin was clarified.

Using the yeast-2-hybrid system, I-mf was identified as a novel binding partner of conductin. In addition, I-mf a is capable of interacting with the GSK3b-inhibitor FRAT-1. I-mf a modulates the competitive binding of conductin and FRAT-1 to GSK3b. I-mf a shields the conductin-bound GSK3b from the competitive attack of FRAT-1. Dissociation of GSK3b fom the degradation complex by is considered a key mechanism how molecules like FRAT-1, but also Dishevelled, activate b-catenin signalling. Thus, the results establish a novel mechanism to regulate such a dissociation behavior.

Diversin was identified in our group by virtue of its binding to conductin, too. Diversin is able to potentiate FRAT-1 mediated activation of the b-catenin signal in a conductin-dependent manner. This synergy is not achieved through increased dissociation of GSK3b fom the dgradation complex. Rather, it can be demonstrated that ternary complexes consisting of conductin, diversin, and GSK3b are essential to the synergistic activation of b-catenin. Ternary complex formation is dependent on conductin dimerization, since dimerization- deficient conductin mutants fail to facilitate triple complex assembly and therefore block the synergy of diversin and FRAT-1. In addition to dimerization, the DIX domain of conductin is important for efficient ternary complex formation, and hence, synergy. Based on these data, diversin is thought to provide an optimal configuration of the conductin-based degradation complex to allow for enhanced FRAT-1 action on the conductin-bound GSK3b. In the canonical Wnt pathway, diversin may regulate lateral inputs coming from FRAT-1 and thus adds a new layer of regulatory complexity.