dc.contributor.author
Rigal, Nathalie
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:48:29Z
dc.date.available
2018-04-05T11:30:32.713Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4297
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8497
dc.description.abstract
Lysosomal storage diseases (LSDs) are a group of rare, inherited metabolic
disorders, whereby the deficiency of a single lysosomal enzyme leads to
accumulation of metabolites in the lysosome cells. This in turn results in
cellular dysfunction and clinical abnormalities such as enlarged organs,
connective-tissue, ocular pathology and central nervous system dysfunction. To
date, there is no cure for LSDs; enzyme replacement therapy (ERT) however can
be used to treat several of these disorders. In such case, a recombinant
enzyme is administered intravenously to patients and routed to the deficient
cells via receptor mediated transport ways. Although ERT has proven to be
successful in slowing down lysosomal storage and improving patient’s quality
of life, there are still a number of unmet needs. This includes A) the
difficulties encountered during the production of the acid hydrolases, in
particular the synthesis of mannose-6-phosphate (M6P), B) the loss of
intravenously administered enzyme to the liver asialoglycoprotein receptor
(ASGPR), C) the inability of ERT to cross the blood brain barrier. In an
effort to address these numerous issues, an attempt was made to develop
“tools” for the production of improved recombinant lysosomal enzymes. The
initial focus was set upon modifying Glycotope’s host cell line in order to
increase M6P levels of the recombinant enzymes and thereby enhancing target-
cell delivery. The resulting cell lines enabled production of recombinant
α-Galactosidase A (GAL) enzymes exposing relative M6P levels close to 80 %,
compared to the initial 40 % of the control enzyme. This increased M6P level
in turn led to a 4-fold increase in receptor-mediated cellular uptake when
tested in vitro. The second objective was the modification of the recombinant
enzyme GAL itself. Emphasis was set upon addressing ASGPR-mediated product
loss to the liver. A fusion enzyme was thereby generated exhibiting an up to
20-fold reduced affinity for the liver ASGPR when assessed in vitro.
Furthermore, in vivo data generated during a mouse pharmacokinetic study,
revealed that the liver uptake of the intravenously administered fusion enzyme
was reduced by around 30 % compared to the reference enzyme. In addition, a
1.5-fold increase in kidney uptake was observed for the fusion enzyme.
Finally, the transport of recombinant enzymes to the brain was investigated.
To this end, several fusion enzyme formats were generated based on the so-
called molecular Trojan-horse technique, whereby molecules are engineered to
bind to transcytosis-triggering receptors (i.e. transferrin receptor (TFR)).
Recombinant fusion products were successfully generated, purified and
characterized in vitro, with at least one enzyme revealing bi-functionality.
Indeed, the fusion product showed catalytic activity on one hand and TFR
binding ability on the other, thus possibly enabling transcytosis across the
BBB.
de
dc.description.abstract
Lysosomale Speicherkrankheiten (LSK) bilden eine Gruppe von seltenen genetisch
bedingten und vererbbaren Stoffwechselerkrankungen. Allen Erkrankungen ist
gemeinsam, dass ein lysosomales Enzym in der Funktionalität eingeschränkt ist
oder komplett fehlt. Stoffwechselprodukte reichern sich zunächst in den
Lysosomen verschiedener Zellen an und gelangen ab einer bestimmten
Konzentration in den extrazellulären Raum. Dies führt zu gesundheitlichen
Störungen und Symptomen, die mit Veränderungen des Zellstoffwechsels verbunden
sind und im weiteren Verlauf zum Zelltod führen. Je nach Art der Erkrankung
kommt es zu Schädigungen des Nervensystems, der Knochen, Muskeln, Nieren und
Milz, des Herzens und weiterer Organe. Seit ca. 10 Jahren stehen
Enzymersatztherapien (ERT) zur Verfügung. Hierbei wird das betroffene Enzym
mittels rekombinanter Proteintechnik hergestellt und dem Patienten durch
regelmäßige Infusionen verabreicht. Obwohl die derzeit eingesetzte ERT in der
Lage ist, einen Teil der fehlende Enzymaktivität in verschiedenen Zellen
auszugleichen, hat sich gezeigt, dass die Herausforderung darin besteht, alle
betroffenen Zellen bzw. Gewebe spezifisch und effizient zu erreichen. Des
Weiteren stellt auch die Herstellung der rekombinanten Enzyme oft eine
Herausforderung dar, insbesondere die schwer steuerbare Synthese von
Mannose-6-Phosphat (M6P). Letztens liegt die größte Herausforderung darin,
dass viele der LSK neurologische Störungen verursachen, die bis heute nicht
durch ERT behandelt werden können. Der Grund dafür ist die Blut-Hirn-Schranke
(BHS), deren Überwindung für größere Moleküle schwierig ist. Zur Optimierung
aktueller ERT wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Leerzelllinie der
Firma Glycotope modifiziert, um die Synthese von M6P zu verbessern. Die
resultierende Zelllinie ermöglichte die rekombinante Expression von
α-Galactosidase A (GAL) Molekülen, die einen bis zu 2-fach höheren M6P Anteil
zeigten. In in vitro Experimente konnte nachgewiesen werden, dass die Aufnahme
der hoch phosphorylierten GAL-Enzyme in Zielzellen verbessert war. Darüber
hinaus wurde das Enzym GAL mittels „Protein-engineering“ so verändert, dass
die hohen Verluste, die aufgrund der Aktivierung des Asialoglycoprotein-
Rezeptors (ASGPR) in der Leber auftreten, verringert werden konnten. Das
resultierende Fusionsenzym wies in vitro eine bis zu 20-fach reduzierte
Bindung an den ASGPR auf. Zusätzlich konnte in vivo in Mäusen gezeigten
werden, dass bis zu 30 % weniger Fusionsenzym in die Leber gelangte. Zuletzt
wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Ansatz initiiert, der den
Transport von rekombinanten Enzymen durch die BHS ermöglichen sollte. Die
Moleküle, die im Rahmen dieses Experimentes erzeugt wurden, beruhen auf dem
Prinzip der „Trojan-horse technology“, wobei ein rekombinantes Protein mittels
„Protein-engineering“ so modifizier wird, dass es an einen Transzytose-
Rezeptor bindet und so durch die BHS geschleust werden kann (z.B.
Transferrinrezeptor). Mehrere Fusionsenzym-Varianten wurden rekombinant
hergestellt, aufgereinigt und in vitro getestet. Es konnte gezeigt werden,
dass mindestens ein Fusionsenzym an den Transferrinrezeptor bindet und somit
möglicherweise durch rezeptorvermittelte Transzytose die BHS durchqueren
könnte.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
lysosomal storage disease
dc.subject
enzyme replacement therapy
dc.subject
blood-brain barrier
dc.subject
recombinant protein expression
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Improving enzyme replacement therapy for lysosomal storage diseases
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2017-06-25
dc.date.embargoEnd
2018-03-29
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000104776-5
dc.title.translated
Verbesserung von Enzymersatztherapie für Lysosomale Speicherkrankheiten
de
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000104776
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000021553
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access