Funktionelle Charakterisierung und zelluläre Interaktionen des putativen Cullin3-E3 Ubiquitin Ligase Substratadapters KCTD5

Abstract

KCTD5 (Potassium channel tetramerization domain containing protein 5) wurde erstmalig als zellulärer Bindungspartner der großen regulatorischen Rep78/Rep68-Proteine des Adeno-assoziierten Virus (AAV-2) identifiziert. Es gehört zu der KCTD-Familie, deren Vertreter sich durch eine N-terminal lokalisierte Domäne mit ausgeprägter Homologie zur T1-Domäne der Kaliumkanal- bildenden Proteine und zur BTB/POZ-Domäne auszeichnen. Viele bisher charakterisierte Proteine mit der BTB/POZ-Domäne sind Substratadapter für Cullin3-basierte Ubiquitin-E3-Ligase-Komplexe und auch für KCTD5 konnte eine direkte Interaktion mit Cullin3, aber nicht mit anderen Cullin-Proteinen nachgewiesen werden. Für ein verbessertes Verständnis möglicher zellulärer Funktionen von KCTD5 wurden in dieser Arbeit zunächst seine Interaktionen mit putativen, im Yeast-two-hybrid-System identifizierten zellulären Bindungspartnern, dem Replikationsfaktor MCM7, dem Zink-Finger Protein ZNF711 und dem bisher kaum charakterisierten Protein FAM193B im Detail untersucht. Das Volllänge-KCTD5-Protein ist überwiegend zytoplasmatisch lokalisiert, am Ende der G2-Phase des Zellzyklus kommt es jedoch in synchronisierten Zellen zu einer verstärkten nukleären Lokalisation. Eine solche kann auch durch die Deletion von C-terminalen KCTD5-Aminosäuren oder durch die Expression der Rep78/Rep68-Proteine, die mit diesen Aminosäuren in Wechselwirkung treten, erreicht werden. In der biochemischen Analyse zeichnen sich diese C-terminalen KCTD5-Deletionsmutanten durch die Bildung sehr stabiler Dimere aus. Für alle drei untersuchten putativen zellulären Interaktionsspartner konnte in Säugerzellen eine lokalisationsabhängige Bindung an KCTD5 nachgewiesen werden. Die nukleär lokalisierten KCTD5-Dimere/Oligomere interagieren dabei verstärkt mit MCM7 und ZNF711, während überwiegend im Zytoplasma lokalisierte Deletionsmutanten und das Wildtyp-Protein eine starke Interaktion und ausgeprägte Kolokalisation mit FAM193B aufweisen. Für ZNF711 und MCM7 ist hingegen eine Kolokalisation mit dem Wildtyp-Protein überwiegend in der G2-Phase zu beobachten, was auf mögliche funktionelle Beteiligungen an der Zytokinese hindeutet. Die Bildung trimerer Komplexe von KCTD5 und Cullin3 mit den drei KCTD5-Bindungspartnern lieferte deutliche Hinweise, dass diese als Substrate des KCTD5-Cullin3-Komplexes dienen könnten. Für keines der drei Proteine konnte jedoch eine KCTD5-Cullin3-vermittelte Poly-Ubiquitinierung und Proteasom-abhängige Degradation nachgewiesen werden. Für ZNF711 führen steigende KCTD5- oder Cullin3-Konzentrationen im Gegenteil zu einer Zunahme der ZNF711-Proteinmenge, die auf der Ebene der Proteinstabilisierung vermittelt wird. Die KCTD5-Cullin3-Komplexe könnten also die Funktion von ZNF711 über eine experimentell schwer nachzuweisende Mono-Ubiquitinierung regulieren. Um eine solche regulatorische Funktion näher zu untersuchen, wurden Reportergen-Assays mit ZNF711-spezifischen Bindestellen durchgeführt. Dabei ergab sich keine Korrelation zwischen der Funktion von ZNF711 als transkriptioneller Regulator und der KCTD5-vermittelten Regulation der ZNF711-Proteinmenge. Auch die FAM193B-Proteinmenge wird durch KCTD5 reguliert, ähnlich wie bei ZNF711 kommt es zu einer Zunahme der Proteinspiegel in Gegenwart hoher KCTD5- oder Cullin3-Konzentrationen. Ob die Regulation von ZNF711 und FAM193B tatsächlich durch KCTD5-vermittelte Mono-Ubiquitinierung erfolgt, muss in weiterführenden Versuchen untersucht werden. Für MCM7 konnte in Übereinstimmung mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen eine Poly- Ubiquitinierung eindeutig nachgewiesen werden, die nicht auf die bisher charakterisierte Akzeptor-Stelle beschränkt war. Weder für die Poly- Ubiquitinierung noch für die damit verbundene Regulation der MCM7-Proteinmenge konnte jedoch ein eindeutiger Einfluss einer veränderten zellulären KCTD5- oder Cullin3-Konzentration gefunden werden. Da KCTD5 sowohl an die AAV-2 Rep78/Rep68-Proteine als auch an MCM7 bindet und MCM7 wiederum als Interaktionspartner von Rep78/Rep68 und essenzieller Faktor für die AAV-2-DNA- Replikation beschrieben war, stellte der AAV-2 Replikationszyklus einen interessanten Ansatz für die Untersuchung der physiologischen Funktion von KCTD5 dar. Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass es nach Expression von Rep78/Rep68 zu einer Schwächung der Bindung zwischen KCTD5 und MCM7 kommt. Ein Einfluss auf die MCM7-Proteinmenge und Ubiquitinierung ließ sich jedoch nicht nachweisen. Da auch die Modulation der MCM7-Konzentration im Gegensatz zu den Literaturdaten keinen Einfluss auf die AAV-2-Replikation ausübte, kann eine mögliche Beteiligung von KCTD5 am AAV-2-Replikationszyklus daher nicht endgültig bewertet werden.

KCTD5 (potassium channel tetramerization domain containing protein 5) has been identified as interaction partner of the large regulatory Rep78/Rep68 proteins of adeno-associated virus (AAV-2). It belongs to the KCTD family characterized by a N-terminal T1 and BTB/POZ homologous domain. Various proteins with the BTB/POZ domain function as substrate adaptors for Cullin3 ubiquitin E3 ligases and KCTD5 interacts directly with Cullin3 but not with other proteins of the Cullin family. The aim of this work was to unravel possible functions of KCTD5 through a detailed investigation of the interaction between KCTD5 and its putative binding partners MCM7, ZNF711 and FAM193B identified by yeast two- hybrid screening. The KCTD5 wild type protein localizes predominantly to the cytoplasm but translocates into the nucleus at the end of the G2 phase in synchronized HeLa cells. KCTD5 nuclear translocation could also be induced by deletion of C-terminal amino acids or overexpression of the AAV-2 Rep proteins, which interact with the same C-terminal KCTD5 region. The C-terminal KCTD5 deletion mutants are characterized by the formation of very stable dimers. The interaction between KCTD5 and its putative cellular binding partners was verified in mammalian cells and strongly depended on the subcellular localization of the respective protein. The cytoplasmic FAM193B preferentially interacted with the wild type KCTD5 protein and mutants located in the cytoplasm. Strong interaction with the mainly nuclear MCM7 and ZNF711 proteins required nuclear translocation of KCTD5 associated with dimer or oligomer formation. The wildtype KCTD5 colocalized with MCM7 and ZNF711 during the late G2 phase of the cell cycle suggesting a KCTD5 involvement in cytokinesis. The formation of trimeric complexes composed of KCTD5, Cullin3 and the respective KCTD5 binding partner provided strong hints that these proteins were substrates for KCTD5-Cullin3 ubiquitin E3 ligase complexes. However, for none of them an influence of the modulation of KCTD5 expression levels on polyubiquitination and proteasome-dependent degradation could be demonstrated. On the contrary, increasing KCTD5 or Cullin3 concentrations lead to an increase in ZNF711 protein levels through stabilization of the protein. It may be speculated that ZNF711 cellular function is regulated by a difficult to detect monoubiquitination mediated by KCTD5-Cullin3 complex. In order to investigate such a ZNF711 regulatory function, reporter gene assays were carried out with ZNF711-specific DNA binding sites. Transcriptional ZNF711 function, however, did not correlate with the increase in protein expression induced by KCTD5. Overexpression of KCTD5 or Cullin3 also led to increasing steady state protein levels of the second KCTD5 binding partner analyzed, the FAM193B protein. A possible regulation of ZNF711 and FAM193B activity by Cullin3-KCTD5 mediated monoubiquitination will require further investigations. In line with published results, MCM7 polyubiquitination could be demonstrated, which was not exclusively limited to the described L2G Box acceptor site. However, altering cellular KCTD5 or Cullin3 concentration had no influence on the MCM7 polyubiquitination or MCM7 protein amount. As could be shown, KCTD5 interacts with both the Rep78/Rep68-Proteins of AAV-2 and MCM7. MCM7 in turn was described as binding partner of Rep78/Rep68 and demonstrated to be essential for AAV-2 DNA-replication. Therefore an involvement of KCTD5 in the regulation of the AAV-2 replication cycle was studied. Whereas Rep78/Rep68 expression was able to weaken the interaction between KCTD5 and MCM7, it was not associated with changes in MCM7 protein levels and polyubiquitination. As opposed to previously published data, the modulation of MCM7 protein concentration did not influence AAV-2 DNA replication, so that a KCTD5 involvement in the AAV-2 replication cycle could not be evaluated conclusively.