Recombinantly expressed spermadhesin AWN and fluorescence based characterization of porcine sperm membranes - prerequisites for functional interaction studies

Abstract

Spermadhesins are seminal plasma proteins of ungulates with multiple functions during reproduction. The porcine (Sus scrofa domestica) spermadhesin AWN is of special interest as it begins to interact with the sperm membrane already in the epididymis. Therefore, AWN together with an additional C-terminal His-tag was recombinantly expressed in E.coli. The purification of recombinant protein from the cell lysate was performed by affinity chromatographies exploiting the His-tag as well as an already postulated heparin affinity followed by size exclusion chromatography. The formation of disulfide bridges postulated for native AWN could be verified by a fluorescein-maleimide-assay. Next, using immunocytochemistry, the binding of recombinant AWN to domestic pig sperm cells was demonstrated. Several methods were then established to facilitate the examination of the interaction of AWN and other spermadhesins with domestic pig sperm in future. Three types of fluorescence microscopic measurements, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS), were successfully established to investigate porcine sperm cells and characterise its membrane. All three methods allowed selective measurements of single cells and sperm membrane subregions after discrimination of individual cells by their viability and functional stages. The three methods differ in their temporal and spatial resolution and therefore their suitability to address diverse biological questions. The screening for the binding of recombinant AWN to lipid stripes revealed a so far unreported selective binding to phosphatidic acid (PA). This opens up new perspectives for the usage of PAmatrices for the purification of AWN also in its glycosylated isoform from the seminal plasma. It resolves also some longstanding methodological controversies in the literature. The results of the lipid- stripe-assays imply that the interaction of AWN with the sperm membrane could be mediated by the proteins affinity to PA. This led to an integrated hypothesis regarding its role during the sperm passage through the genital tract. Initially, the binding of AWN might potentially protect or respectively stabilize accumulations of several charged PA molecules in the sperm membrane. Later, only after the arrival at the oocyte’s zona pellucida, AWN’s displacement would be induced and the ionophoric and membrane destabilizing properties of the PA would be activated exactly when their reactivity is needed for the acrosome reaction. This work sets the stage for understanding the functional role of spermadhesins during the fertilization process. Especially the proposed dual function of AWN in the stabilization of the membrane as well as in its preparation for fusion processes might be used to optimize assisted reproduction in endangered wildlife porcine species, particularly if only epididymal sperm cells are available for species conservation.

Spermadhesine sind Seminalplasmaproteine von Huftieren mit vielfältigen Funktionen während der Fortpflanzung. Von besonderem Interesse ist dabei das porcine (Sus scrofa domestica) Spermadhesin AWN, welches bereits in der Epididymis direkt mit der Spermienmembran interagiert. Im Zuge dieser Arbeit wurde es daher, versehen mit einem C-terminalen His-tag, rekombinant in E.coli exprimiert. Die Aufreinigung aus dem Zelllysat erfolgte durch Affinitätschromatographien, welche den His-tag sowie eine bereits postulierte Heparin-Affinität nutzten, sowie durch eine anschließende Größenausschlusschromatographie. Die Ausbildung der für natives AWN postulierten Disulfidbrücken konnte durch einen Fluorescein-Maleimid-Assay nachgewiesen werden. Mittels Immuncytochemie konnte nachgewiesen werden, dass das rekombinante AWN an Eberspermien bindet. Um künftig die Interaktion des AWN sowie weiterer Spermadhesine mit Eberspermien genauer untersuchen zu können, wurden fluoreszenzmikroskopische Methoden – Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) und Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) – für die Messung an porcinen Spermien etabliert und zur Membrancharakterisierung genutzt. Alle drei Methoden erlauben selektive Messungen an einzelnen Zellen und Regionen der Spermienmembran bei gleichzeitiger Unterscheidung der Zellen bezüglich Vitalität und Entwicklungszustand. Sie unterscheiden sich dabei in ihrer zeitlichen und räumlichen Auflösung und damit in ihrer Eignung für verschiedene biologische Fragestellungen. Das Screening der Bindung von rekombinantem AWN an Lipidstreifen ergab eine bisher nicht beschriebene selektive Affinität zu Phosphatidsäure (PA). Dies eröffnet unter Anderem neue Perspektiven für die Nutzung von PA-Matrizen zur Aufreinigung von AWN auch in seiner glykosylierten Isoform aus dem Seminalplasma. Die Ergebnisse der Lipidstreifenassays legen nahe, dass die Interaktion des AWN mit der Spermienmembran auf seiner Affinität zu PA basieren könnte und führten zu einer umfassenden Hypothese bezüglich seiner Rolle während der Spermienpassage durch den Genitaltrakt. Die Bindung von AWN würde zunächst einen potenziellen Schutz bzw. die Stabilisierung von Ansammlungen geladener PA Moleküle in der Spermienmembran bewirken. Erst bei Erreichen der Zona Pellucida der Eizelle könnte die Ablösung von AWN induziert und die ionophore und membrandestabilisierende Eigenschaft der PA genau dann aktiviert werden, wenn diese Reaktivität für die Akrosomreaktion nötig ist. Die vorliegende Arbeit bereitet die Grundlage für ein Verständnis der funktionellen Rolle der Spermadhesine im Befruchtungsprozess. Die postulierte duale Funktion von AWN sowohl bei der Stabilisierung der Spermienmembran als auch ihrer Vorbereitung auf Fusionsereignisse kann perspektivisch auch artübergreifend zur Optimierung der assistierten Reproduktion genutzt werden, insbesondere wenn zur Arterhaltung nur epididymale Spermien zur Verfügung stehen.