Establishment and application of CRISPR/Cas Technology in Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM)

Abstract

Non-tuberculous mycobacteria (NTM) are increasingly recognized for their impact on human health, causing infections, especially in individuals with compromised immune systems or underlying lung conditions. Unlike the well-known Mycobacterium tuberculosis (MTB), NTM's intrinsic resistance to common antibiotics poses treatment challenges. Diagnosing NTM infections is complicated due to nonspecific symptoms, often confused with other diseases. Understanding NTM biology is crucial for improved diagnostics and treatments. The adoption of CRISPRi (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats interference) and CRISPR/Cas9 in NTM represents a significant breakthrough for advancing NTM research and treatment.

The study applied the CRISPRi/dCas9 system to NTM species (M. smegmatis, M. abscessus, and M. avium), using a reporter eGFP gene for functional analysis. CRISPRi led to significant downregulation of eGFP in M. smegmatis and M. abscessus. In M. avium, reduced fluorescence, even without sgRNA, suggested the need for further optimization. CRISPRi proved effective for gene knockdown in M. abscessus.

CRISPR/Cas9 was employed to knockout the eGFP gene, resulting in loss of fluorescence in M. smegmatis and M. avium but not in M. abscessus. Assessing the system on the mps1 gene in M. abscessus revealed defects in Glycopeptidolipid synthesis, causing morphotype transition. Evaluation on endogenous genes (porin, ppiA, erm-41, and whiB7) showed successful knockout for porin and ppiA. However, targeting erm-41 and whiB7 indicated the need for system optimization.

The successful establishment of CRISPRi and CRISPR/Cas9 in NTM signifies a milestone, offering new avenues for research and potential therapies. These technologies enable precise genomic manipulation, enhancing our understanding of NTM biology and facilitating the development of more effective NTM infection treatments.

Nicht-tuberkulöse Mykobakterien (NTM) werden zunehmend für ihre Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit erkannt, da sie Infektionen verursachen, insbesondere bei Personen mit geschwächtem Immunsystem oder zugrunde liegenden Lungenerkrankungen. Im Gegensatz zum bekannten Mycobacterium tuberculosis (MTB) stellt die intrinsische Resistenz von NTM gegen gängige Antibiotika eine Herausforderung für die Behandlung dar. Die Diagnose von NTM-Infektionen ist aufgrund unspezifischer Symptome, die häufig mit anderen Krankheiten verwechselt werden, kompliziert.

Das Verständnis der NTM-Biologie ist für eine verbesserte Diagnose und Behandlung von entscheidender Bedeutung. Die Einführung von CRISPRi (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Interference) und CRISPR/Cas9 bei NTM stellt einen bedeutenden Durchbruch für die Weiterentwicklung der NTM-Forschung und -Behandlung dar.

Die Studie wendete das CRISPRi/dCas9-System auf NTM-Arten (M. smegmatis, M. abscessus und M. avium) an und verwendete ein Reporter-eGFP-Gen für die Funktionsanalyse. CRISPRi führte zu einer signifikanten Herunterregulierung von eGFP bei M. smegmatis und M. abscessus. Bei M. avium deutete die verringerte Fluoreszenz, auch ohne sgRNA, auf die Notwendigkeit einer weiteren Optimierung hin. CRISPRi erwies sich als wirksam für den Gen-Knockdown bei M. abscessus.

CRISPR/Cas9 wurde eingesetzt, um das eGFP-Gen auszuschalten, was zu einem Fluoreszenzverlust bei M. smegmatis und M. avium führte, nicht jedoch bei M. abscessus. Die Untersuchung des Systems auf dem mps1-Gen in M. abscessus ergab Defekte in der Glycopeptidolipid-Synthese, die einen Morphotypübergang verursachten.

Die erfolgreiche Etablierung von CRISPRi und CRISPR/Cas9 in der NTM stellt einen Meilenstein dar und eröffnet neue Wege für die Forschung und mögliche Therapien. Diese Technologien ermöglichen eine präzise Genommanipulation, verbessern unser Verständnis der NTM-Biologie und erleichtern die Entwicklung wirksamerer NTM-Infektionsbehandlungen.