Structural and dynamic properties of MHCII-peptide complexes

Abstract

The proteins of the Major Histocompatibility Complex (MHC) present peptidic antigens to T lymphocytes. Antigens of extracellular origin are thereby displayed by class II MHC molecules. In order to present these antigens a universal placeholder peptide, CLIP, has to be replaced. However this exchange process is not yet understood at atomic detail, despite the existence of numerous MHC-peptide crystal structures. Nuclear magnetic resonance (NMR) is the most comprehensive method to investigate molecules at the atomic level in solution. The strict requirement for relatively large amounts of highly homogeneous protein has so far hampered NMR investigations of MHC molecules. In the presented work the human MHCII protein HLA-DR1 was broadly investigated by NMR-spectroscopic methods for the first time. The incorporation of stable NMR isotopes, protein purification and refolding from bacterial inclusion bodies were optimized. An assignment of resonances to atoms of the protein backbone was achieved with high resolution-multi-dimensional spectra. This enabled the delineation of residues that are affected by the exchange of CLIP for a viral peptide in vitro. Moreover, characteristic differences between empty and loaded MHCII as well as its domain organization and stability were confirmed at the atomic level. The combined use of NMR data and crystal structures revealed a bipartite orientation of CLIP peptides when bound to HLA-DR1. Their thermodynamic equilibrium was governed by several H-bonds close to the P1 pocket of the MHC-peptide complex. Peptide reorientation from canonical to inverted binding was monitored by NMR and showed this process to be accelerated by the natural peptide exchange catalyst HLA-DM. In the second part of the thesis, xenon-detection by NMR was invoked to observe the binding of the viral peptide HA to HLA-DR1. The functionalization of HA peptide with cryptophane allowed its detection by characteristic resonances from caged xenon-129 atoms. This process set the stage for the indirect detection of Cage-HA by saturation transfer during the exchange of xenon with cryptophane. The characterization of Cage-HA revealed a high comparability to wild-type HA. The peptide was administered to mice and was shown to evoke an HLA-DR1/HA- restricted T lymphocyte response. These results lay the foundation for the use of xenon-based MR-imaging of inflammation.

Proteine des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) präsentieren peptidische Antigene gegenüber T-Lymphozyten. Antigene extrazellulärer Herkunft werden dabei durch MHCII-Moleküle ausgewiesen. Als Voraussetzung für Antigenpräsentation muss das universelle Platzhalterpeptid CLIP ersetzt werden. Dieser Prozess ist trotz zahlreicher MHC-Peptid-Kristallstrukturen im molekularen Detail nicht verstanden. Kernmagnetresonanzspektroskopie (NMR) ist die umfassendste Methode zur atomar-aufgelösten Untersuchung von Molekülen in Lösung. Die Notwendigkeit großer Mengen homogenen Proteins hat NMR- Untersuchungen an MHC-Molekülen bisher erschwert. In der vorliegenden Arbeit wurde das humane MHCII-Protein HLA-DR1 erstmalig umfassend NMR-spektroskopisch untersucht. Der Einbau stabiler NMR-Isotope, die Proteinreinigung und Rückfaltung aus bakteriellen inclusion bodies wurden optimiert. Es wurde eine Zuordnung von Resonanzen des Proteinrückgrats über hochaufgelöste, mehrdimensionale Spektren erreicht. Dies ermöglichte die Bestimmung von sensiblen Resten während des Austauschs von CLIP durch ein virales Peptid in vitro. Zudem konnten charakteristische Unterschiede zwischen unbeladenem und beladenem Protein und dessen Domänenstruktur/-stabilität auf atomarer Ebene bestätigt werden. Die Kombination aus NMR-Daten und Kristallstrukturen ergab einen neuartigen Bindungsmodus einer CLIP-Variante an HLA-DR1, was durch das Fehlen von essentiellen Wasserstoffbrücken im kanonischen Bindungsmodus von CLIP erklärt wurde. Mittels NMR konnte die Umlagerung aus der kanonischen Peptid-Orientierung in eine invertierte verfolgt werden, was zudem durch den natürlichen Peptidaustauscher HLA-DM katalysiert wurde. Im zweiten Teil der Arbeit wurde Xenon-detektierte NMR zur Beobachtung der Bindung des viralen Peptids HA an HLA-DR1 verwendet. Die Funktionalisierung des Peptids mit Kryptophan erlaubte seine Detektion durch die charakteristische NMR-Resonanz eingeschlossener Xenon-129-Atome. Dies war Grundlage für die indirekte Detektion von Kryptophan-HA mittels Sättigungstransfer bei Austausch von Xenon mit Kryptophan. Die Charakterisierung von Kryptophan-HA ergab eine hohe Vergleichbarkeit mit HA. Das Peptid konnte als applikabel an Mäuse und immunogen für HLA-DR1/HA-restrizierte T-Lymphozyten eingestuft werden. Die Ergebnisse sind als Grundlage zur Verwendung von Xenon in der Magnetresonanz- tomographischen Visualisierung von Entzündungen zu sehen.