Aktivitäten des Nichtstrukturproteins 1 bei der Vermehrung von Influenza B Virus in humanen Zellen

Abstract

Infektionen durch Influenza A oder B Viren können schwere oder letale Krankheitsverläufe zur Folge haben. Der multifunktionelle Virulenzfaktor NS1 spielt dabei für den Verlauf der Infektion aufgrund einer Blockade von angeborenen antiviralen Abwehrreaktionen der Zelle eine entscheidende Rolle. Die in silico-Identifikation des in über 300 Influenza B Virusstämmen konservierten NS1-Sequenzmotivs 121-Y-P-x-x-P-x-(K/R)-127 mit Homologie zum Klasse II-SH3-Bindemotiv (PxxPxK/R) wies auf bisher unbekannte Funktionen des NS1-Proteins hin, deren Bedeutung für die Interaktionen von Virus und Wirt, sowie den viralen Vermehrungsverlauf in der vorliegenden Arbeit analysiert wurde. Zur Untersuchung des NS1-Sequenzmotivs wurden Virusmutanten mit Aminosäuresubstitutionen in dem hochkonservierten Bereich durch Methoden der reversen Genetik hergestellt. Überraschenderweise führte die vollständige Substitution des 122-P-x-x-P-x-(K/R)-127-Motivs durch 122-G-g-g-G-g-G-127 (xSH3G) nicht zu einer Reduktion des Virustiters, sondern zu einer gesteigerten Virusreplikation von bis zu drei Log-Stufen in humanen Zellen. Diese Steigerung ging mit verstärkter viraler Genexpression im Vergleich zum Wildtyp einher, wobei die IFN-beta-Expression der infizierten Zellen nicht beeinflusst wurde. In einem globalen Ansatz konnte mittels quantitativer Massenspektrometrie-basierter Proteomik gezeigt werden, dass die xSH3G- Substitution zur Bindung des B/NS1-Proteins an das Chaperon HSP90beta führt. Sowohl diese Interaktion als auch die Manipulation der Crk/JNK/ATF2-, Akt- und PKR-vermittelten zellulären Signalwege korrelierten mit einer verstärkten Apoptoseinduktion in den xSH3G-Virus-infizierten Zellen. Zudem konnte gezeigt werden, dass die NS1-xSH3G-Mutation eine Interaktion des HSP90beta-Chaperons mit der viralen Polymeraseuntereinheit PB2 zur Folge hat. Dieses Ergebnis deutet in Analogie zu Untersuchungen der Influenza A Virusreplikation darauf hin, dass infolge der HSP90-PB2-Bindung eine Steigerung der Viruspolymeraseassemblierung im Zellkern die erhöhte Virusvermehrung der xSH3G-Virusvariante indiziert. Die vorliegende Arbeit präsentiert eines von wenigen bisher bekannten Beispielen, bei dem die Substitution einer hochkonservierten Sequenz in einem viralen Protein zu verstärkter Replikationsfähigkeit der Virusmutante führt. Die Ergebnisse der durchgeführten Untersuchungen verdeutlichen, dass durch Mutationsanalyse eines viralen Proteins nicht nur die ursprünglichen Funktionen der substituierten Aminosäuren verloren gehen, sondern auch unerwartete Protein-Protein- Interaktionen und -aktivitäten auftreten können. Eine Überexpression von HSP90 könnte in Zukunft bei der Vakzinherstellung genutzt werden, um die Influenzavirusproduktion in Zellkultur zu optimieren.

Infections with influenza A or B virus can lead to serious or lethal courses of disease. The multifunctional virulence factor NS1 plays a crucial role for the course of infection by blocking the innate antiviral immune response of infected cells. The in silico identification of the highly conserved motif 121-Y-P-x-x-P-x-(K/R)-127 with homology to the class II SH3 binding motif (PxxPxK/R) within the NS1 sequence of more than 300 influenza B virus strains indicated previously unknown protein functions. The importance of these protein functions for interactions of virus and host cell as well as for viral replication was analyzed in the presented study. To investigate the NS1 protein motif virus mutants with amino acid substitution within the highly conserved region were generated by methods of reverse genetics. Surprisingly, the entire substitution of 122-P-x-x-P-x-(K/R)-127 to 122-G-g-g-G-g-G-127 (xSH3G) did not lead to a reduction of virus titer, but to increased virus replication up to three log levels in human cells. This enhanced virus propagation involved increased gene expression compared to wildtype, but had no effect on IFN-beta expression levels of infected cells. In a global approach using quantitative mass spectrometry based proteomics it could be shown that xSH3G substitution leads to binding of the B/NS1 protein to the chaperon HSP90beta. Both, this interaction and manipulation of Crk/JNK/ATF2-, Akt- and PKR-mediated cellular signaling pathways correlated with increased apoptosis induction in xSH3G-infected cells. It was also demonstrated that the NS1-xSH3G mutations lead to interaction of HSP90beta with the viral polymerase subunit PB2. This result indicates that HSP90-PB2 binding might induce increased virus propagation by the enhancement of virus polymerase assembly in the cell nucleus by analogy with investigations of influenza A virus replication. The presented study shows one of only few known examples where substitution of a highly conserved sequence within a viral protein leads to increased replication of the virus mutant. The results illustrate that mutations within a viral protein may not only lead to a loss of the natural functions, but can also result in the occurrence of unexpected protein-protein interactions and activities. In future, overexpression of HSP90 might be used to optimize influenza virus production in cell culture for vaccine generation.