Funktion basischer Aminosäuren für die synergistische Zytotoxizität von Ribosomen-inaktivierenden Proteinen und Triterpensaponinen

Abstract

Die synergistische Zytotoxizität zwischen Ribosomen-inaktivierenden Proteinen und Triterpensaponinen beruht auf dem Triterpensaponin-vermittelten endosomal escape von Typ I RIPs. Typ I RIPs wirken zytotoxisch, indem sie einen spezifischen Adeninrest von der rRNA abspalten. Die Abspaltung hat das Erliegen der Proteinsynthese und den Zelltod zur Folge. Damit Typ I RIPs ihre Toxizität ausüben können, müssen sie aus den Endo- und Lysosomen freigesetzt werden, andernfalls werden sie proteolytisch abgebaut. Spezifische Triterpensaponine bewirken dabei, dass Typ I RIPs dem endolysosomalen Abbau entkommen, indem sie in das Zytosol freigesetzt werden. Bisherige Untersuchungen deuteten darauf hin, dass Triterpensaponine pH-abhängig an Typ I RIPs binden und dadurch die endolysosomale Freisetzung induzieren. Die essenzielle Glucuronsäure an C-3 der Triterpensaponine, negativ geladen in Endo- und Lysosomen, könnte dabei mit basischen Aminosäuren der Typ I RIPs, positiv geladen in Endo- und Lysosomen, interagieren. Voraussetzung für die weiteren Untersuchungen dieser Arbeit war das Erbringen des Nachweises der Bindung von SO1861 und HisDianthin, der bisher nur am Beispiel von HisSaporin-3 erbracht wurde. Massenspektrometrische Aufnahmen unter nativen Bedingungen zeigten bei pH 6,24 für SO1861 und HisDianthin eine Assoziation im stöchiometrischen Verhältnis von 1:1. Der Einfluss basischer Aminosäuren auf die bestätigte Interaktion zwischen SO1861 und HisDianthin wurde an 19 HisDianthin-Mutanten, bei denen Lysin- und Arginin-Reste durch Alanin ersetzt wurden, anhand ihrer synergistischen Zytotoxizität untersucht. Für die ausgewählten Lysin-Reste konnte keine Beteiligung an der synergistischen Zytotoxizität nachgewiesen werden. Einzig die synergistische Zytotoxizität von HisDianthin Arg24Ala war im Vergleich zu dem nativen HisDianthin reduziert. Die aufgetretene Reduktion der Zytotoxizität war nicht zelllinienabhängig. Allerdings war sie auch ohne Anwesenheit von SO1861 reduziert, bei gleichzeitig unbeeinträchtigter N-Glykosidaseaktivität. Die Markierung von HisDianthin Arg24Ala und HisDianthin mit Fluoreszenzfarbtsoff erlaubte via Durchflusszytometrie, die verminderte Zytotoxizität auf eine verringerte Endozytose zurückzuführen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass die untersuchten Arginin- und Lysin-Reste der Typ I RIPs nicht hauptverantwortlich für die Interaktion mit SO1861 zu sein scheinen. Um aufzuklären, auf welcher Interaktion die Bindung zwischen Typ I RIPs und Triterpensaponinen, die vermutlich dem endosomal escape zu Grunde liegt, beruht, müssen weitere Experimente durchgeführt werden. Um die Funktion von Arg24 an weiteren Typ I RIPs validieren zu können, wurden aus den Samen der Gypsophila vaccaria (L.) Sm. die RIP-Isoformen Sapovaccarin-S1 und -S2 isoliert und sequenziert. Das Isoformengemisch wies eine für Typ I RIPs typische Proteinsequenz auf. Die N-Glykosidaseaktivität und die Thermostabilität waren mit denen von isolierten Typ I RIPs vergleichbar. Die Untersuchung der Funktion der Aminosäure Arg24 an den Typ I RIPs HisSapovaccarin-S1 und HisAgrostin bestätigte, dass auch hier eine Reduktion der Zytotoxizität zu verzeichnen war. Die durchgeführten Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Funktion von Arginin an Position 24, die am HisDianthin aufgezeigt werden konnte, sich auch auf die Endozytose von HisAgrostin und HisSapovaccarin-S1, wenn nicht sogar auf Typ I RIPs im Allgemeinen übertragen lässt.

The synergistic cytotoxicity between ribosome-inactivating proteins and triterpene saponins is due to the endosomal escape of type I RIPs induced by triterpene saponins. Type I RIPs are toxins that cleave off a specific adenine residue from rRNA. As a result, protein synthesis is inhibited, which is followed by cell death. To avoid degrading and to exert their cytotoxicity, type I RIPs must be released from endosomes/lysosomes. Specific triterpen saponins act as endosomal escape enhancers by releasing the toxin into the cytosol. Previous studies have suggested that endolysosomal release is triggered by pH-dependent binding of triterpene saponins to type I RIPs. The negatively charged essential glucuronic acid at position C-3 of triterpene saponins could interact in endo-/lysosomes with positively charged basic amino acid residues of type I RIPs. A prerequisite for further investigations of this research was the demonstration of the binding of SO1861 and Hisdianthin, which has so far only been demonstrated using the type I RIP Hissaporin-3. Mass spectrometry under native conditions revealed a binding of SO1861 and Hisdianthin at pH 6.24 with a stoichiometric ratio of 1:1. The effect of basic amino acid residues on the interaction confirmed above between SO1861 and Hisdianthin were examined for the synergistic cytotoxicity of 19 Hisdianthin mutants. Lysine and arginine residues were substituted by alanine. The selected lysine residues did not contribute to synergistic cytotoxicity. Only Hisdianthin Arg24Ala reduced the synergistic cytotoxicity when compared to native Hisdianthin. The reduction in cytotoxicity was not cell line specific. However, cytotoxicity was reduced even without the presence of SO1861, whereas N-glycosidase activity was not affected. Hisdianthin Arg24Ala and Hisdianthin labelling allowed flow cytometry to attribute the reduction in cytotoxicity to decreased endocytosis. In this research, it has been shown that the studied arginine and lysine residues of type I RIPs do not seem to be primarily responsible for the interaction with SO1861. The interaction between type I RIPs and triterpene saponins, which presumably underlies the endosomal escape, could not be clarified further. To validate the effect of Arg24 on other type I RIPs, the RIP isoforms sapovaccarin-S1 and -S2 were isolated from the seeds of Gypsophila vaccaria (L.) Sm. and their protein sequence determined. The isoform mixture exhibited a typical type I RIP protein sequence, N-glycosidase activity and thermal stability comparable to other isolated type I RIPs. Examination of the effect of Arg24Ala in the type I RIPs Hissapovaccarin-S1 and Hisagrostin confirmed that the same mutation caused reduced cytotoxicity. This research suggests that the function of arginine at position 24, first shown in the example of Hisdianthin, can be transferred to the endocytosis of Hissapovaccarin-S1 and Hisagrostin, and possibly to the endocytosis of type I RIPs in general.