Development of predictive tenacity models for Campylobacter along the raw milk supply chain

Abstract

In the last years many foodborne outbreaks in Germany were caused by Campylobacter spp. in raw milk that had not been properly heat treated prior to consumption. Feces from Campylobacter-colonized cows pose a risk for cross-contamination of teats, which can transfer the Campylobacter spp. contamination into raw milk during the milking process. The aim was to identify and fill data gaps regarding Campylobacter spp. transfer along the supply chain of raw milk and to investigate its survival in raw milk. Finally, possible intervention strategies to minimize the risk from raw milk consumption were outlined. A systematic review and meta-analysis was performed to summarize previous research on Campylobacter spp. in feces of dairy cows worldwide. The prevalence varied widely from 0-100%. Only limited quantitative data on Campylobacter spp. in the feces of dairy cows were available. The reported Campylobacter mean concentrations ranged between 2.1 and 4.17 log CFU/g feces. A longitudinal study was performed to investigate the transmission of Campylobacter spp. along the raw milk supply chain. The investigated samples comprised rectal feces, boot socks, teat skin swabs, milking cluster swabs, raw milk and milk filters. Samples were analyzed for the presence and concentration of Campylobacter spp., E. coli, total aerobic colony count (TACC) and for Pseudomonas spp. In total, Campylobacter spp. were detected in 77.1% of the fecal samples with an average concentration of 2.43 ± 0.9 log CFU/g. Of the boot sock samples 29.2% were tested positive with a mean concentration of 3.01 ± 1.05 log CFU/two socks. Among the teat swabs, 12.2% tested positive for Campylobacter spp. None of the milking clusters were positive. Only one raw milk sample and the milk filter tested positive on the same day. In addition, on this day nine teat swab samples were tested positive for Campylobacter spp. The results showed that contamination of raw milk, albeit rare, can occur. The survival of C. jejuni was investigated by two different methods, culturally according to ISO 10272-2 and in addition using a quantitative polymerase chain reaction specifically detecting viable Campylobacter spp. in raw milk (v-qPCR). The experiment was performed at three temperatures (5°C, 8°C, and 12°C). While only colony-forming units (CFU) can be detected according to ISO 10272-2, the newly developed v-qPCR (Wulsten et al., 2020) allows detection of intact and potentially infectious units (IPIU), which includes CFU and viable but non-culturable units (VBNC). According to Wulsten et al. (2020) who performed their experiments at 5°C, the survival was also underestimated in our study by CFU for the strains and temperature tested. To date, the infectious potential of Campylobacter spp. in VBNC status is unknown. Wulsten et al. (2020) demonstrated that C. jejuni VBNCs developed upon incubation in raw milk at 5°C were recovered into a cultivable state (recovery) within a certain time period (at least 90 h), using a specific gas mixture with a lower oxygen level for 72 h. Here, the recovery was investigated at 8°C and 12°C. The recovery time periods for both strains were longer at 8°C (up to 80 h) compared to 12°C (at least up to 48 h). Hence, the recovery period shortened with increasing temperature. Predictive models providing a rapid response for predicting microbial behavior in the food environment were developed on the two generated data sets. Three tertiary models consisting of one for all IPIU data and two for the CFU data, were provided to predict the survival of C. jejuni in raw milk between 5°C and 12°C. Finally, a quantitative microbial risk assessment (QMRA) model was developed. Through various uncertainty analyses, parameters with the greatest impact on the risk for consumers for drinking Campylobacter spp. contaminated raw milk were identified. In addition to the initial concentration of Campylobacter spp. in cow feces, the prevalence of contaminated teats had a major impact on the risk of consuming Campylobacter-contaminated raw milk. In summary, transmission of Campylobacter spp. can occur due to cross-contamination of teats by cow feces into the raw milk. However, this is a rare event. Clean udders are therefore of crucial importance. It was shown that survival of C. jejuni is underestimated based on CFU data compared to VBNC data at different temperatures in raw milk. The overall data are valuable to support risk managers in controlling Campylobacter spp. More CFU and IPIU data are needed to improve the developed predictive models. The significance of the finding on underestimated survival should be determined through studies, e.g., in animal models, on the infectivity of Campylobacter spp. in VBNC status, within and beyond the time window in which VBNC can be recovered to CFU.

In den letzten Jahren wurden viele lebensmittelbedingte Krankheitsausbrüche in Deutschland durch Campylobacter spp. in Rohmilch verursacht, die vor dem Verzehr nicht ordnungsgemäß wärmebehandelt wurde. Der Kot von Campylobacter-besiedelten Kühen stellt ein Risiko für eine Kreuzkontamination der Zitzen dar, wodurch die Kontamination mit Campylobacter spp. während des Melkens in die Rohmilch übertragen werden kann. Ziel war es, Datenlücken in Bezug auf die Übertragung von Campylobacter spp. entlang der Lieferkette von Rohmilch zu ermitteln und zu schließen sowie das Überleben von Campylobacter spp. in Rohmilch zu untersuchen. Schließlich wurden mögliche Interventionsstrategien zur Minimierung des Risikos durch Rohmilchkonsum dargelegt. Eine systematische Übersichtsarbeit und Meta-Analyse wurde durchgeführt, um die bisherige Forschung zu Campylobacter spp. im Kot von Milchkühen weltweit zusammenzufassen. Die Prävalenz variierte stark von 0-100%. Es liegen nur begrenzte quantitative Daten über Campylobacter spp. in den Fäkalien von Milchkühen vor. Die berichteten mittleren Campylobacter-Konzentrationen lagen zwischen 2,1 und 4,17 log CFU/g Kot. In einer Längsschnittstudie wurde die Übertragung von Campylobacter spp. entlang der Warenkette Rohmilch untersucht. Die untersuchten Proben umfassen rektalen Kot, Stiefelsocken, Zitzenhautabstriche, Melkzeugabstriche, Rohmilch und Milchfilter. Die Proben wurden auf das Vorhandensein und die Konzentration von Campylobacter spp. und E. coli sowie auf die Gesamtzahl aerober Kolonien (TACC) und Pseudomonas spp. untersucht. Insgesamt wurden Campylobacter spp. in 77,1 % der Kotproben mit einer durchschnittlichen Konzentration von 2,43 ± 0,9 log KBE/g nachgewiesen. Von den Stiefelsockenproben wurden 29,2 % positiv getestet mit einer mittleren Konzentration von 3,01 ± 1,05 log CFU/zwei Socken. Die kontaminierte Stallumgebung stellte ein Risiko für eine fäkale Kreuzkontamination der Zitzen der Kühe dar. Von den Zitzenabstrichen wurden 12,2 % positiv auf Campylobacter spp. getestet. Keines der Melkzeuge war positiv. Nur eine Rohmilchprobe und ein Milchfilter wurden am selben Tag positiv getestet. Außerdem wurden an diesem Tag neun Zitzenabstriche positiv auf Campylobacter spp. getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Kontamination von Rohmilch, wenn auch selten, vorkommen kann. Die Überlebensfähigkeit von C. jejuni wurde mit zwei verschiedenen Methoden untersucht: kulturell nach ISO 10272-2 und zusätzlich unter Verwendung einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion zum spezifischen Nachweis lebensfähiger Campylobacter spp. in Rohmilch (v-qPCR). Der Versuch wurde bei drei Temperaturen (5°C, 8°C und 12°C) durchgeführt. Während gemäß ISO 10272-2 nur koloniebildende Einheiten (CFU) nachgewiesen werden können, ermöglicht die neu entwickelte v-qPCR (Wulsten et al., 2020) den Nachweis von intakten und potenziell infektiösen Einheiten (IPIU), die CFU und lebensfähige, aber nicht kultivierbare Einheiten (VBNC) umfassen. Nach Wulsten et al. (2020), die ihre Experimente bei 5°C durchführten, wurde die Überlebensrate auch in unserer Studie für die getesteten Stämme und Temperaturen um die KBE unterschätzt. Bislang ist das infektiöse Potenzial von Campylobacter spp. im VBNC-Status unbekannt. Wulsten et al. (2020) wiesen nach, dass C. jejuni VBNCs, die sich bei einer Inkubation in Rohmilch bei 5 °C entwickelt hatten, innerhalb eines bestimmten Zeitraums (mindestens 90 Stunden) wieder in einen kultivierbaren Zustand überführt wurden (Erholung), wobei ein spezifisches Gasgemisch mit einem niedrigeren Sauerstoffgehalt für 72 h verwendet wurde. Hier wurde die Erholung bei 8°C und 12°C untersucht. Die Erholungszeiträume für beide Stämme waren bei 8°C (bis zu 80 h) länger als bei 12°C (mindestens bis zu 48 h). Die Erholungszeit verkürzte sich also mit steigender Temperatur. Vorhersagemodelle wurden anhand der beiden generierten Datensätze entwickelt, die eine schnelle Reaktion zur Vorhersage des mikrobiellen Verhaltens in der Lebensmittelumgebung ermöglichen. Drei tertiäre Modelle, bestehend aus einem für alle IPIU-Daten und zwei für die CFU-Daten, wurden erstellt, um das Überleben von C. jejuni in Rohmilch zwischen 5°C und 12°C vorherzusagen. Schließlich wurde ein Modell zur quantitativen mikrobiellen Risikobewertung (QMRA) entwickelt. Durch verschiedene Unsicherheitsanalysen wurden die Parameter ermittelt, die den größten Einfluss auf das Risiko für Verbraucher haben, mit Campylobacter spp. kontaminierte Rohmilch zu trinken. Neben der Ausgangskonzentration von Campylobacter spp. im Kuhkot hatte die Prävalenz von kontaminierten Zitzen einen großen Einfluss auf das Risiko des Konsums von Campylobacter-kontaminierter Rohmilch. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Übertragung von Campylobacter spp. durch eine Kreuzkontamination von Zitzen mit Kuhkot in Rohmilch erfolgen kann. Dies ist jedoch ein seltenes Ereignis. Saubere Euter sind von entscheidender Bedeutung. Es wurde gezeigt, dass die Überlebensrate von C. jejuni auf der Grundlage von KBE-Daten im Vergleich zu VBNC-Daten bei verschiedenen Temperaturen in Rohmilch unterschätzt wird. Die Gesamtdaten sind hilfreich, um Risikomanager bei der Überwachung von Campylobacter spp. zu unterstützen. Um die entwickelten Vorhersagemodelle zu verbessern, werden mehr CFU- und IPIU-Daten benötigt. Die Bedeutung des Ergebnisses der unterschätzten Überlebensrate sollte durch Studien, z. B. in Tiermodellen, über die Infektiosität von Campylobacter spp. im VBNC-Status innerhalb und außerhalb des Zeitfensters, in dem VBNC zu KBE zurückgewonnen werden kann, ermittelt werden.