Endothelial heterogeneity in response to autophagy activation prompts distal vascular muscularization in pulmonary hypertension

Abstract

Background: Accumulating evidence points to an ambiguous role of autophagy activa-tion in the development of pulmonary hypertension (PH). Here, we speculate that au-tophagy activation may induce differential responses in macro- and micro-vascular en-dothelial cells, resulting in the proliferation of pulmonary artery endothelial cells (PAEC) and autophagic cell death of microvascular endothelial cells (MVEC). Thus, proliferating PAEC may replace MVEC in pulmonary precapillary arterioles, driving small vessel muscularization and the development of PH. Methods: Proliferative and apoptotic states were evaluated by ki67 and cleaved caspa-se 3 (Cl-Cas3) immunostaining, respectively, in human and rat PAEC and MVEC, and in precision cut lung slices (PCLS) of wild-type (WT) mice or mice with an endothelial-specific autophagy related gene 7 deletion (Atg7EN-KO). To probe for replacement of MVEC by PAEC, we discriminated between PAEC as Weibel-Palade body positive (WPbs+) endothelial cells (ECs) by transmission electron microscopy (TEM) and Griffo-nia simplicifolia positive (GS+) MVEC by immunofluorescence. Right heart hemodynam-ics and hypertrophy were quantified by right ventricular systolic pressure (RVSP) and Fulton index measurements, respectively. Vascular muscularization was quantified by immunohistostaining of α-actin. Results: Immunostaining results, both in vitro and in vivo, revealed an increased prolif-eration of PAEC and apoptosis of MVEC under hypoxia as compared to normoxia. These distinct responses were prevented in hypoxic Atg7EN-KO mice, with reduced prolif-eration in PAEC and inhibited apoptosis of MVEC compared to hypoxic WT mice. Chronic hypoxia increased the abundance of WPbs+ PAEC and decreased GS+ MVEC in precapillary arterioles, suggesting that MVEC were replaced by PAEC, while this phenomenon was reversed in hypoxic Atg7EN-KO mice. Conditioned medium from hypox-ic PAEC, not MVEC, stimulated smooth muscle cell (SMC) proliferation and migration. Chronic hypoxia resulted in elevated RVSP, Fulton index, and distal vessel musculariza-tion in WT mice that was attenuated in Atg7EN-KO mice. Conclusion: Hypoxia-induced autophagy activation in parallel promotes PAEC prolif-eration and MVEC apoptosis. These antithetical responses to autophagy cause prolifer-ative PAEC to replace MVEC in small pulmonary arterioles, promoting SMC proliferation and migration, ultimately driving distal vessel muscularization and the development of PH.

Hintergrund: Zahlreiche Hinweise deuten auf eine relevante Autophagie-Aktivierung bei der Entwicklung der pulmonalen Hypertonie (PH) hin; deren Rolle ist bislang aber unklar. Hier spekulieren wir, dass die Autophagie-Aktivierung unterschiedliche Reaktionen in makro- und mikrovaskulären Endothelzellen auslösen könnte, was zur Proliferation von Lungenarterien-Endothelzellen (PAEC) und zum autophagischen Zelltod von mikrovaskulären Endothelzellen (MVEC) führt. Somit könnten proliferierende PAEC die MVEC in den pulmonalen präkapillären Arteriolen ersetzen und so die Muskularisierung der kleinen Gefäße und die Entwicklung der PH befördern. Methoden: Zellproliferation und -apoptose wurden durch ki67- bzw. Cl-Cas3-Immunfärbung in PAEC und MVEC von Mensch und Ratte sowie in präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten (PCLS) von Wildtyp-Mäusen (WT) oder Mäusen mit einer endothelspezifischen Deletion des Autophagie-Gens Atg7 (Atg7EN-KO) untersucht. Um den Ersatz von MVEC durch PAEC zu untersuchen, identifizierten wir PAEC mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) als Weibel-Palade Körperchen positive (WPbs+) Endothelzellen (ECs) und MVEC mittels Immunfluoreszenz als Griffonia simplicifolia positive (GS+) EC. Hämodynamik und Hypertrophie des rechten Herzens wurden durch Messung des systolischen Drucks der rechten Herzkammer (RVSP) bzw. des Fulton-Index quantifiziert. Die vaskuläre Muskularisierung der Lunge wurde durch Immunhistologische Färbung von α-Actin quantifiziert. Ergebnisse: Die Ergebnisse der Immunfärbungen in vitro als auch in vivo zeigten eine erhöhte Proliferation von PAEC und die Apoptose von MVEC unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie. Diese Reaktionen waren bei hypoxischen Atg7EN-KO-Mäusen vermindert, insofern dass die Proliferation von PAEC reduziert und die Apoptose von MVEC im Vergleich zu hypoxischen WT-Mäusen gehemmt waren. Chronische Hypoxie erhöhte das Vorkommen von WPbs+ PAEC und verringerte die Zahl GS+ MVEC in präkapillären Arteriolen. Dies weist darauf hin, dass MVEC durch PAEC ersetzt wurden. Hingegen war dieses Phänomen bei hypoxischen Atg7EN-KO-Mäusen umgekehrt. Konditioniertes Medium von hypoxischen PAEC, nicht aber solches von MVEC, stimulierte die Proliferation und Migration von glatten Muskelzellen (SMC). Chronische Hypoxie führte bei WT-Mäusen zu einem erhöhtem RVSP, einem Anstieg des Fulton-Index und distaler Gefäßmuskularisierung, diese Veränderungen waren bei Atg7EN-KO-Mäusen abgeschwächt. Schlussfolgerung: Hypoxie-induzierte Autophagie-Aktivierung fördert parallel die Proliferation von PAEC und die Apoptose von MVEC. Diese gegensätzlichen Reaktionen auf Autophagie führen dazu, dass proliferative PAEC die MVEC in den kleinen Lungenarteriolen ersetzen, wodurch die SMC-Proliferation und -Migration gefördert wird, was letztlich zur Muskularisierung der distalen Gefäße und zur Entwicklung einer PH führt.