A versatile Cell-free Protein Production Platform for the Synthesis of multifunctional Enzymes

Abstract

Enzymes are indispensable proteins for all types of organisms, capable of fulfilling various functions by catalyzing diverse chemical reactions. This makes them important tools not only for fundamental research in biochemistry but also for applied research in pharmacology and organic chemistry. However, the recombinant production of enzymes is not trivial, and conventional isolations and expressions from cells are often unsuitable for many applications due to decreased enzyme activity. Cell-free protein synthesis can simplify the synthesis of some enzymes that were previously difficult to produce. Representatives of various enzyme classes were synthesized and subsequently analyzed. Modifications to the established synthesis platforms based on translationally active CHO and Sf21 lysates were made. These modifications allowed for the production of a soluble enzyme, a representative of the hydrolases, GH78 from Xylaria polymorpha. Kinetic analyses after synthesis optimization confirmed the kinetic similarity to the naturally synthesized enzyme. In particular, temperature and synthesis condition adjustments, as well as DNA template modifications, were found to increase enzyme activity. Efforts to adapt a cell-free synthesis platform for the production of further active fungal enzymes, mainly comprising unspecific peroxygenases in active CHO lysates have not yet yielded successful results. However, progress has been made in laying the foundation for future advancements, including the generation of templates, successful synthesis, and the establishment of activity assays. To provide a mammalian enzyme alternative to the unspecific peroxygenases, difficult-to-express monooxygenases comprising members of the cytochrome P450 enzyme family (CYP), the membrane-bound enzymes CYP1A2, CYP2B6, and CYP3A4 from Homo Sapiens, were produced in a eukaryotic translationally active cell lysate. By genetically modifying the CHO cells used for lysate production, an increased amount of CPR, the coenzyme of CYPs, was integrated into the endogenous membrane vesicles of the lysate, thus increasing the activity of the cell-free produced CYPs. Further adaptations of the synthesis, such as synthesis temperature and supplementation with heme, led to further increases in CYP activity in the endogenous membrane vesicles. This allowed for exemplary screening experiments with known CYP substrates.

Enzyme sind unverzichtbare Proteine für alle Arten von Organismen, die durch Katalyse verschiedener chemischer Reaktionen verschiedene Funktionen erfüllen können. Dies macht sie nicht nur für die Grundlagenforschung in der Biochemie, sondern auch für die angewandte Forschung in der Pharmakologie und organischen Chemie zu wichtigen Werkzeugen. Die rekombinante Produktion von Enzymen ist jedoch nicht trivial, und herkömmliche Isolations- und Expressionsmethoden aus Zellen sind oft für viele Anwendungen aufgrund verringerte Enzymaktivität ungeeignet. Die zellfreie Proteinsynthese kann die Synthese einiger zuvor schwer herstellbarer Enzyme vereinfachen. Vertreter verschiedener Enzymklassen wurden synthetisiert und anschließend analysiert. Modifikationen an den etablierten Syntheseplattformen basierend auf translationsaktiven CHO- und Sf21-Lysaten wurden vorgenommen. Diese Modifikationen ermöglichten die Produktion eines löslichen Enzyms, eines Vertreters der Hydrolasen, GH78 von Xylaria polymorpha. Kinetische Analysen nach Optimierung der Synthese bestätigten die kinetische Ähnlichkeit zum natürlichen Enzym. Insbesondere Temperatur- und Synthesebedingungsanpassungen sowie Modifikationen der DNS-Vorlage wurden durchgeführt, um die Enzymaktivität zu erhöhen. Die Anpassung einer zellfreien Syntheseplattform zur Produktion weiterer aktiver Pilzenzyme, hauptsächlich von unspezifischen Peroxygenasen in translationsaktiven CHO-Lysaten, hat bisher keine erfolgreichen Ergebnisse erbracht. Es wurden allerdings bereits die ersten Schritte, insbesondere die Generierung von DNS-Template, erfolgreicher erste Synthesen und der Etablierung von Aktivitätsassays durchgeführt. Als Alternative zu den unspezifischen Peroxygenasen, wurden schwer herstellbare Monooxygenasen der Cytochrom-P450-Enzymfamilie (CYP), in einem eukaryotischen translationsaktiven Zelllysat produziert. Durch genetische Modifikation, der für die Lysatproduktion verwendeten CHO-Zellen wurde, eine erhöhte Menge an CPR, dem Coenzym der CYPs, in die endogenen Membranvesikel des Lysats integriert, was die Aktivität der CYPs erhöhte. Weitere Anpassungen der Synthese, wie z.B. die Synthesetemperatur und die Zugabe von Häm, führten zu weiteren Steigerungen der CYP-Aktivität in den endogenen Membranvesikeln. Dies ermöglichte exemplarische Screening-Experimente mit bekannten CYP-Substraten.