Polychromatic flow cytometry and immune cell-specific gene expression profiling: an integrated approach to identify and validate new biomarkers and signatures of immune responses in chronic inflammatory rheumatic diseases

Abstract

Autoimmune diseases like ankylosing spondylitis (AS), rheumatoid arthritis (RA) and systemic lupus erythematosus (SLE) are characterised by chronic inflammatory immune responses towards the body’s own tissues. Uncertain diagnosis especially in early states and not fully understood etiopathology hamper a curative breakthrough in these diseases. This work introduces a novel multicolour flow cytometry approach for the development of diagnostic procedures based on a complex characterization of the inflammatory condition by simultaneous assessment of numerous peripheral blood leukocyte subsets from the expression of 50 surface CD antigens. A newly developed bioinformatic strategy for the analysis of 800 immunophenotypic parameters revealed a distinct pattern of differentially expressed surface molecules from AS patients compared to healthy individuals. In phenotypes, that determined the pattern of AS from the peripheral blood, the expression of surface molecules CD14, CD1c, CD1a, CXCR4, CD62L and CD69 was most pronounced. An even more enhanced expression of the above-mentioned molecules has also been demonstrated on cells from the synovial fluid of patients with AS, which showed impressively that this pattern typical for a local inflammation could be evaluated already from the analysis of immune cells in the peripheral blood. A comparable analysis of the peripheral blood from AS, RA and SLE patients indicated that not a single marker but a characteristic pattern of differently regulated surface molecules, in terms of an immunophenotypic signature, made it possible to distinguish between various rheumatic diseases. In addition, complex flow cytometric immunophenotyping provides an attractive opportunity to validate candidate genes at the protein level, which were identified by gene expression studies. Cell-specific gene expression analysis of peripheral monocytes from SLE patients showed a dominant type I interferon (IFN) signature. As a reliable surrogate marker for type I IFN-induced responses, the sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 1 (Siglec-1) could be validated by flow cytometry. The frequency of Siglec-1 expressing peripheral monocytes correlating with disease activity proved to be useful as a potential biomarker for the therapeutic follow-up. The gene expression signature identified in monocytes after in vitro stimulation with tumor necrosis factor α (TNFα) compared to the signature in peripheral monocytes from RA patients showed an overlapping profile of predominantly down-regulated genes. This finding emphasizes the contribution of TNFα to the disease immunopathology at the transcriptional level. A therapeutic blockade of TNFα reverses this transcriptional signature, suggesting that one could predict treatment response or failure from the peripheral blood prior to initiation of therapy. In summary, comprehensive immunophenotyping of peripheral leukocytes by polychromatic flow cytometry provides a promising systems biology approach to characterizing aberrant immune responses. The presented disease-specific cytometric immunophenotypic signatures along with validated biomarkers and immune cell-specific gene expression signatures could contribute to the development of new diagnostic procedures for classification of diseases, assessment of disease activity and stratification of the therapy.

Autoimmunerkrankungen wie Spondylitis ankylosans (AS), rheumatoide Arthritis (RA) und systemischer Lupus erythematodes (SLE) sind durch eine chronisch- entzündliche Immunantwort gegen eigene Gewebe gekennzeichnet. Unsicherheit in der Diagnose vor allem in frühen Stadien und eine bisher nicht vollständig verstandene Ätiopathologie erschweren eine kurative Therapie dieser Erkrankungen. Diese Arbeit stellt ein neues Konzept zur Entwicklung diagnostischer Verfahren auf der Basis polychromatischer Durchflusszytometrie vor, bei dem der Entzündungszustand durch die gleichzeitige Beurteilung von 50 CD-Oberflächenantigenen und damit zahlreichen Leukozyten-Subpopulationen im peripheren Blut umfassend beschrieben wird. Eine neu entwickelte Bioinformatik-Strategie für die Analyse von 800 immunphänotypischen Parametern ergab bei AS-Patienten ein eindeutig typisches Muster von Oberflächenantigenen im Vergleich zu gesunden Personen. In den Phänotypen, die das Muster für die AS aus dem peripheren Blut bestimmten, war die Expression der Oberflächenmoleküle CD14, CD1c, CD1a, CXCR4, CD62L und CD69 am markantesten. Eine noch deutlicher erhöhte Expression der oben genannten Moleküle auf Zellen aus der Synovialflüssigkeit von AS-Patienten zeigte eindrucksvoll, dass dieses für eine lokale Entzündung typische Muster schon durch die Analyse von Immunzellen aus dem peripheren Blut bewertet werden kann. Die vergleichende Analyse des peripheren Blutes von AS-, RA- und SLE-Patienten zeigte an, dass nicht einzelne Marker sondern erst ein charakteristisches Muster verschiedenartig regulierter Oberflächenmoleküle, im Sinne einer immunphänotypischen Signatur, eine Unterscheidung der verschiedenen rheumatischen Erkrankungen erlaubt. Darüber hinaus bietet die komplexe durchflusszytometrische Immunphänotypisierung eine attraktive Möglichkeit, die Relevanz von Kandidatengenen, die durch Genexpressionsanalysen identifiziert wurden, auf Proteinebene zu prüfen. So zeigten zellspezifische Genexpressionsanalysen peripherer Monozyten von SLE-Patienten eine dominante Typ-I-Interferon-(IFN)-Signatur. Für diese Typ-I-IFN-induzierten Antworten konnte als zuverlässiger Surrogatmarker das Sialinsäure-bindende Immunglobulin-ähnliche Lektin 1 (Siglec-1) mit Hilfe der Durchflusszytometrie validiert werden. Die Frequenz der Siglec-1-exprimierenden peripheren Monozyten korrelierte mit der Krankheitsaktivität und könnte sich damit als potentieller Biomarker in der Verlaufskontrolle als nützlich erweisen. Die Genexpressionssignatur von Monozyten nach in-vitro-Stimulation mit Tumornekrosefaktor α (TNFα) zeigte im Vergleich zur Signatur peripherer Monozyten von RA-Patienten ein überlappendes Profil überwiegend herunterregulierter Gene, was den Beitrag von TNFα zur Krankheitsimmunpathologie auf der Transkriptionsebene unterstreicht. Eine therapeutische Blockade von TNFα hebt diese transkriptionelle Signatur auf, was darauf hinweist, dass Therapieansprechen oder -Versagen bereits vor Beginn der Therapie aus dem peripheren Blut vorhergesagt werden könnte. Zusammenfassend bietet umfassende Immunphänotypisierung der peripheren Leukozyten mittels polychromatischer Durchflusszytometrie ein vielversprechendes neues systembiologisches Herangehen, um die aberranten Immunantworten zu charakterisieren. Die vorgestellten krankheitsspezifischen zytometrischen Signaturen unter Einbeziehung der validierten Biomarker könnten in Verbindung mit den immunzellspezifischen Genexpressionsignaturen zur Entwicklung neuer diagnostischer Verfahren hinsichtlich der Klassifizierung von Krankheiten, Beurteilung der Krankheitsaktivität und Therapiestratifizierung beitragen.