Development and characterization of a new in vitro method to study the cellular immune response of microglia and astrocytes and the underlying crosstalk

Abstract

Diseases of the central nervous system (CNS) are a global health threat to both humans and animals with high mortality rates and frequent occurrence of convalescence, occasionally also including long-term sequela. Thus, the role of the different CNS cell types involved is at the forefront of comprehending the development, function, and diseases of the brain. The CNS cell type glia includes microglia and astrocytes, both are crucial players in the brain and are involved in pathogen defense, innate immune activation, and signaling. Their intimate crosstalk maintains the delicate balance between homeostasis and rapid detection of invading pathogens and has progressively gathered research attention. Therefore, the improvement of methods for the isolation, cultivation, and purification of distinct CNS-derived cell types at a high viability and purity is indispensable in order to study the individual contributions of cellular populations to the proper function of the brain. The objective of this study was to develop an in vitro protocol for the isolation, cultivation, and purification of highly viable and pure microglia and astrocytes from neonatal mice and subsequently investigate their cell type-specific effects as well as their contribution to the CNS immune response and cellular crosstalk. In the first step, a glial isolation protocol was developed by optimizing pre-existing techniques for the in vitro isolation and cultivation of microglia and astrocytes from whole neonatal murine brains. Microglial cell yields were maximized by stimulating with macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and applying multiple microglial harvests derived from the same mixed glial culture. Then, a purification protocol for magnetic-activated cell sorting (MACS®) was improved by using cultivated primary glial cell suspensions instead of directly sorting dissociated single cell suspensions. Thereby, microglia and astrocytes were successfully isolated, cultivated, and MACS-purified at a purity of 99-100%, as confirmed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis. Furthermore, glial cells generated with our novel protocol are highly viable (~100%) and show a preserved integrity, as demonstrated by field emission scanning electron microscopy (FESEM). Subsequently, non-purified and MACS-purified microglial and astrocyte monocultures were stimulated with different TLR ligands. Their pro- and anti-inflammatory response was determined by using Tumor necrosis factor (TNF) and Interleukin-10 (IL-10) enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). In fact, these experiments demonstrated a significantly weakened protein response in MACS-purified microglia and astrocytes in contrast to the non-purified glial monocultures, providing the first hint of a microglia-astrocyte crosstalk. In the next step, our hypothesis of an existing crosstalk was reinforced by stimulating TLR2-knockout (TLR2-KO) microglial and astrocyte monocultures with wild-type (WT) supernatants (SN) derived from the respective other glial cell type. Here, a significant TNF protein release by TLR2-KO astrocyte monocultures was observed, which were activated with microglial WT SN in response to Pam3CSK4, in comparison to the untreated control. Interestingly, transcriptome analysis using RNA sequencing (RNA-seq) unraveled a wide array of significantly up- and down-regulated genes in comparison to their untreated controls, which may be candidate mediators of the intimate molecular glial conversation. Finally, co-culture experiments with microglia and astrocytes coming from different genetic backgrounds were performed. Interestingly, a significant TNF protein release by Pam3CSK4-activated WT microglia co-cultured with TLR2-KO astrocytes was detected in comparison to the untreated control, confirming the results from the prior monoculture experiments. In this thesis, we describe a novel protocol to optimize in vitro isolation, cultivation, and purification of neonatal murine primary microglia and astrocytes. With our proposed method, we maximized microglial yields with the big advantage of sacrificing as few mice as possible following the principles of the 3Rs (replacement, reduction, and refinement). By using ~100% pure glial mono-/co-cultures derived from mice with different genotypes, we were able to analyze the microglia-astrocyte crosstalk on a cell-specific level. Moreover, unlike previous protocols, we showed that the immune response during the crosstalk underlies a TLR2/1-dependent mechanism. Consequently, we postulate our novel protocol to be a suitable and efficient method to investigate cell type-specific effects which contributes to immune modulation as well as cellular crosstalk in future approaches. Thereby, we further extended the possibilities to study glial cells in different experimental issues on brain function as well as CNS infections.

Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) stellen eine globale Gesundheitsbedrohung für Mensch und Tier dar, mit hohen Mortalitätsraten und häufigem Auftreten von Rekonvaleszenzen, aber auch gelegentlichen Langzeitfolgen. Somit steht die Rolle der verschiedenen ZNS-Zelltypen im Vordergrund, um die Entwicklung, Funktion und Erkrankungen des Gehirns zu verstehen. Der ZNS-Zelltyp Glia umfasst Mikroglia und Astrozyten, die beide entscheidende Akteure im Gehirn sind und an der Abwehr von Pathogenen, der Aktivierung des angeborenen Immunsystems sowie der Signalübertragung beteiligt. Ihr enger „crosstalk“ hält das empfindliche Gleichgewicht zwischen Homöostase und der schnellen Detektion von eindringenden Pathogenen aufrecht und hat zunehmend die Aufmerksamkeit der Forschung erlangt. Folglich ist die Verbesserung von Methoden zur Isolierung, Kultivierung und Aufreinigung unterschiedlicher ZNS-relevanter Zelltypen mit hoher Vitalität und Reinheit unerlässlich, um die individuellen Beiträge von Zellpopulationen zur einwandfreien Funktion des Gehirns zu untersuchen. Das Ziel dieser Studie war die Entwicklung eines in vitro-Protokolls für die Isolierung, Kultivierung und Aufreinigung hochvitaler und reiner Mikroglia und Astrozyten aus neonatalen Mäusen sowie die anschließende Untersuchung ihrer zelltypspezifischen Effekte und ihres Beitrages zur Immunantwort des ZNS sowie des zellulären crosstalk. Im ersten Schritt wurden bestehende Techniken zur in vitro-Isolierung und Kultivierung von Mikroglia und Astrozyten aus ganzen neonatalen Mäusegehirnen optimiert, um ein Protokoll zur Isolierung von Gliazellen zu entwickeln. Die Ausbeute an Mikrogliazellen wurde maximiert, indem mit dem Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) stimuliert sowie mehrere Mikroglia-Ernten aus derselben gemischten Glia-Kultur gewonnen wurden. Anschließend wurde ein Reinigungsprotokoll für magnetic-activated cell sorting (MACS®) verbessert, indem kultivierte primäre Glia-Suspensionen anstelle von direkt-sortierten dissoziierten Einzelzell-Suspensionen verwendet wurden. Dadurch konnten Mikroglia und Astrozyten erfolgreich isoliert, kultiviert und zu 99-100% aufgereinigt werden, was durch fluorescence-activated cell sorting (FACS) bestätigt werden konnte. Darüber hinaus waren die mit unserem neuen Protokoll generierten Gliazellen hoch lebensfähig (~100%) und wiesen eine intakte Morphologie auf, was durch Rasterelektronenmikroskopie gezeigt wurde. Anschließend wurden nicht aufgereinigte und MACS-aufgereinigte Mikroglia- und Astrozyten-Monokulturen mit verschiedenen TLR-Liganden stimuliert. Ihre pro- und anti-inflammatorische Reaktion wurde durch enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) für Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) und Interleukin-10 (IL-10) bestimmt. Tatsächlich zeigten diese Experimente eine signifikant abgeschwächte Proteinantwort in den MACS-aufgereinigten Mikroglia- und Astrozyten-Monokulturen im Vergleich zu den nicht aufgereinigten Glia-Monokulturen und lieferten damit den ersten Hinweis auf einen Mikroglia-Astrozyten crosstalk. Im nächsten Schritt wurde unsere Hypothese eines vorhandenen crosstalk bekräftigt, indem TLR2-Knockout (TLR2-KO) Mikroglia- und Astrozyten-Monokulturen mit Wildtyp (WT)-Überständen (ÜS) aus den jeweils anderen Glia-Zelltypen stimuliert wurden. Hierbei wurde eine signifikante Ausschüttung von TNF-Proteinen in TLR2-KO Astrozyten-Monokulturen beobachtet, die mit Pam3CSK4-aktivierten ÜS aus WT Mikroglia stimuliert wurden, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Interessanterweise deckte eine Transkriptom-Analyse mittels RNA sequencing (RNA-seq) eine Vielzahl signifikant hoch- und herunterregulierter Gene im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen auf, die potenzielle Mediatoren des engen molekularen crosstalk sein könnten. Schließlich wurden Co-Kultur-Experimente mit Mikroglia und Astrozyten aus verschiedenen genetischen Hintergründen durchgeführt. Interessanterweise wurde eine signifikante Freisetzung von TNF-Proteinen in Pam3CSK4-aktivierten Co-Kulturen aus WT Mikroglia und TLR2-KO Astrozyten, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, beobachtet, was die Ergebnisse der vorherigen Monokultur-Experimente bestätigte. In dieser Arbeit beschreiben wir ein neues Protokoll zur Optimierung der in vitro-Isolierung, Kultivierung und Reinigung von neonatalen murinen primären Mikroglia und Astrozyten. Mit unserer vorgeschlagenen Methode haben wir die Mikroglia-Ausbeute maximiert, mit dem großen Vorteil, so wenig Mäuse wie möglich gemäß den Prinzipien der 3R (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) zu nutzen. Durch die Verwendung von ~100% reinen Glia-Mono-/Co-Kulturen aus Mäusen mit unterschiedlichen Genotypen konnten wir den Mikroglia-Astrozyten crosstalk auf zellulärer Ebene analysieren. Im Gegensatz zu früheren Protokollen haben wir gezeigt, dass die Immunantwort während des crosstalk einem TLR2/1-abhängigen Mechanismus unterliegt. Folglich postulieren wir unser neues Protokoll als eine geeignete und effiziente Methode, um zelltypspezifische Effekte zu untersuchen, die zur Immunmodulation sowie zum zellulären crosstalk in zukünftigen Ansätzen beitragen. Hierdurch haben wir die Möglichkeiten zur Untersuchung von Gliazellen in verschiedenen experimentellen Fragestellungen zur Hirnfunktion sowie zu ZNS-Infektionen erweitert.