Design and generation of antibody-drug conjugates using non-canonical amino acids

Abstract

Antibody-drug conjugates are cancer therapeutics that combine specificity and toxicity through the antibody and its conjugated drug, respectively. Due to their unique structures and chemical functions, non-canonical amino acids enable tailor-made designs of protein conjugates and their generation in a direct and efficient manner. The CHO-based cell-free protein synthesis, based on translationally active CHO lysates and microsomes, is of high relevance since antibodies are produced in CHO cells at the industrial scale. It represents a promising analytical tool for investigating the CHO-translation, ER-related post-translational modifications, folding, and assembly of a protein of interest, as well as their effects on the protein properties. The aim of this doctoral work was to leverage the unique specificities and advantages of these non-canonical amino acids to address recurrent and unresolved challenges in ADCs, thereby enhancing their developability. The second aim of this doctoral work was to harness the unique characteristics of this CHO-based cell-free protein synthesis to support the development of such ADCs. In this context, a disruptive clickable antibody design based on non-canonical amino acids was created and evaluated. In this unconventional design, the drug-linker was buried within the Fab cavity, similar to a Trojan horse-type approach. This allowed for the decrease of the adverse effects associated with the exposition of the drug-linker, such as hydrophobicity. This design, which outperformed conventional and best-in-class designs, has the potential to significantly increase the developability of ADCs. Additionally, the first method for the CHO-based cell-free orthogonal synthesis as well as the conjugation of IgG1 was established. This method opens, for the first time, the possibility of investigating the folding and assembly of IgG1 containing non-canonical amino acids synthesized in CHO systems as well as their conjugability at a post-translational level. Finally, the first CHO-based cell-free dual fluorescence technology was created and characterized. This technology enabled, for the first time, the direct, precise, and reliable analysis of amber suppression, which opens possibilities for investigating the orthogonal synthesis of antibodies containing non-canonical amino acids at a translational level. Aside from the achieved aims, this doctoral work brings major contributions and breakthroughs in the field of ADCs and CHO-based cell-free protein synthesis.

Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (Antibody-drug conjugates, ADCs) sind Krebstherapeutika, die Spezifität und Toxizität jeweils durch den Antikörper und den daran konjugierten Wirkstoff kombinieren. Aufgrund ihrer einzigartigen Strukturen und chemischen Funktionen ermöglichen nicht-kanonische Aminosäuren maßgeschneiderte Designs von Protein-Konjugaten und deren Generierung auf direkte und effiziente Weise. Die CHO-basierte zellfreie Proteinsynthese, basierend auf translational aktiven CHO-Lysaten und Mikrosomen, ist von hoher Relevanz, da Antikörper in CHO-Zellen im industriellen Maßstab produziert werden. Sie stellt ein vielversprechendes analytisches Tool dar, um die CHO-Translation, ER-assozierte post-translationale Modifikationen, Faltung und Assemblierung des Proteins von Interesse sowie deren Auswirkungen auf die Proteineigenschaften zu untersuchen. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, die einzigartigen Spezifika und Vorteile dieser nicht-kanonischen Aminosäuren zu nutzen, um wiederkehrende und ungelöste Herausforderungen bei ADCs anzugehen und damit ihre Entwicklung zu verbessern. Das zweite Ziel war es, die einzigartigen Merkmale der CHO-basierten zellfreien Proteinsynthese zu nutzen, um die Entwicklung solcher ADCs zu unterstützen. In diesem Kontext wurde ein disruptives, klickbares Antikörperdesign auf Basis nicht-kanonischer Aminosäuren kreiert und evaluiert. In diesem unkonventionellen Design wurde der Wirkstoff-Linker innerhalb der Fab-Kavität verborgen, ähnlich wie bei einem Trojanischen Pferd-Ansatz. Dies ermöglichte die Verringerung der nachteiligen Effekte, die mit der Exposition des Wirkstoff-Linkers, wie Hydrophobizität, verbunden sind. Dieses Design, das konventionelle und Best-in-Class-Designs übertraf, hat das Potenzial, die Entwickelbarkeit von ADCs signifikant zu erhöhen. Zusätzlich dazu wurde die erste Methode zur CHO-basierten zellfreien orthogonalen Synthese sowie Konjugation von IgG1 etabliert. Diese Methode eröffnet für das erste Mal die Möglichkeit, die Faltung und Assemblierung von IgG1 mit nicht-kanonischen Aminosäuren, die in CHO-Systemen synthetisiert wurden, sowie deren Konjugierbarkeit auf post-translationaler Ebene zu untersuchen. Schließlich wurde die erste CHO-basierte zellfreie Dual-Fluoreszenztechnologie entwickelt und charakterisiert. Diese Technologie ermöglichte erstmalig, die direkte, präzise und zuverlässige Analyse der Amber-Suppression in CHO-Systemen, und eröffnet Möglichkeiten zur Untersuchung der orthogonalen Synthese von Antikörpern mit nicht-kanonischen Aminosäuren auf translationaler Ebene. Neben den erreichten Zielen bringt diese Doktorarbeit bedeutende Beiträge und Durchbrüche auf dem Gebiet der ADCs und der CHO-basierten zellfreien Proteinsynthese.