Klonierung und Charakterisierung des ersten equinen CLCA-Homologen, eCLCA1, und erste Untersuchungen zu seiner Bedeutung bei chronisch-obstruktiver Bronchiolitis des Pferdes

Abstract

Bei der chronisch-obstruktiven Bronchiolitis der Pferde (COB; recurrent airway obstruction, RAO) stellt die Becherzellmetaplasie und -hyperplasie mit einer hieraus resultierenden Dyskrinie und Obstruktion der kleinen Luftwege einen zentralen Pathomechanismus dar. Dabei finden sich klinisch, pathogenetisch und histologisch zahlreiche Ähnlichkeiten zum Asthma bronchiale des Menschen. Die vor wenigen Jahren entdeckte Genfamilie der CLCA- Chloridkanäle (CLCA = engl. chloride channel, calcium activated) scheint eine zentrale Funktion bei der Muzinsynthese in Becherzellen und bei der Sekretion von Ionen und Wasser an epithelialen Barrieren einzunehmen. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass es bei Asthma bronchiale zu einer transkriptionellen Aufregulation von mCLCA3 bei der Maus und hCLCA1 beim Menschen kommt. Diese CLCA-Proteine kommen als frühe Auslöser der Becherzellmetaplasie und -hyperplasie und somit der Dyskrinie in Frage und scheinen folglich maßgeblich an der Pathogenese beteiligt zu sein. Ziel dieser Studie war es, die Rolle eines equinen Homologen zu hCLCA1 und mCLCA3 bei der chronisch-obstruktiven Bronchiolitis des Pferdes zu charakterisieren. Hierzu wurde zunächst der entsprechende equine Vertreter der CLCA-Chloridkanäle, eCLCA1, identifiziert, kloniert und charakterisiert. Eine Sequenzanalyse identifizierte eCLCA1 als direkten Orthologen zu hCLCA1 und mCLCA3. Es wurden zwei eCLCA1-Allelvarianten, die sich durch insgesamt drei Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) unterscheiden, identifiziert. Die beiden Allele scheinen in der Pferdepopulation etwa gleich stark verteilt zu sein. Nach Erzeugung von spezifischen anti- eCLCA1-Antikörpern wurde das eCLCA1-Protein immunhistochemisch in Muzin- produzierenden Becherzellen des Respirations- und Intestinaltraktes sowie in Schweißdrüsen der Haut und Schleimdrüsen der Nieren lokalisiert. In Gesamtgewebsproben des Atmungstraktes von Pferden mit COB wurde eine deutliche Überexpression von eCLCA1 durch Immunhistochemie und quantitative real-time RT-PCR gezeigt. Das eCLCA1-Protein wurde in hyper- und metaplastischen, bronchiolären und trachealen Becherzellen und in intraluminal gelegenem Schleim COB-erkrankter Pferde lokalisiert. Morphometrische Untersuchungen zeigten eine signifikante Zunahme von eCLCA1-exprimierenden Becherzellen bei COB sowohl in Bronchien und Bronchiolen als auch in der Trachea. Die Ermittlung der eCLCA1-mRNA Expressionsrate auf Einzelzellebene mittels laser capture microdissection und anschließender quantitativer RT-PCR hingegen konnte keinen Unterschied zwischen COB-kranken Pferden und gesunden Tieren aufzeigen, so dass die in Gesamtgewebsproben ermittelte Überexpression vermutlich auf die Zunahme der Becherzellanzahl zurückzuführen ist und nicht auf eine transkriptionelle Aufregulation. Die mehr als zweifache Zunahme an eCLCA1-exprimierenden Becherzellen bei COB weist dennoch auf eine signifikante, funktionelle Rolle dieses Moleküls bei COB hin. Dabei wären die erhobenen Befunde sowohl mit einer primär-pathogenetischen Rolle von eCLCA1 bei der COB als auch mit einer sekundären, eventuell kompensatorischen Funktion vereinbar, möglicherweise über eine induzierte Aktivierung Kalzium- aktivierter Chloridströme zur vermehrten Befeuchtung des Atemwegschleims. Neben ihrem Modellcharakter für das Asthma des Menschen, bei dem eine derartige Untersuchung kaum durchgeführt werden kann, können die Ergebnisse bei zukünftigen Untersuchungen eingesetzt werden, die auf ein besseres Verständnis der eigentlichen Funktion von eCLCA1 abzielen.

Goblet cell hyper- and metaplasia and a resulting mucus overproduction and obstruction of small airways are key mechanisms of chronic obstructive bronchiolitis in horses (COB; recurrent airway obstruction, RAO). There are numerous clinical, functional and histological similarities between COB and human asthma. Members of the CLCA gene family (chloride channels, calcium activated) have recently been shown to be critically involved in epithelial disorders with aberrant mucus production including asthma and cystic fibrosis. Specifically, the human hCLCA1 and the murine mCLCA3 induce goblet cell metaplasia and overproduction of mucins and are prime candidates as genetic modulators in childhood asthma an murine models of asthma. The aim of this study was to determine the role of an equine CLCA-family member in the pathogenesis of chronic obstructive bronchiolitis in horses. In this study, the first equine homologue of the CLCA gene family, eCLCA1, was identified, cloned and characterized. Sequence analyses identified eCLCA1 as the equine orthologue of the human hCLCA1 and the murine mCLCA3. Two allelic variations of eCLCA1 with three single nucleotide polymorphisms (SNP) were identified, with an approximately equal distribution in the equine population. Immunohistochemical analyses using antibodies raised against eCLCA1 identified expression in various mucin producing cells in the respiratory and alimentary tracts as well as in the kidney and skin. Importantly, real-time RT-qPCR as well as immuno-histochemistry disclosed a strong upregulation of eCLCA1 in the airways of horses suffering from COB. The eCLCA1 protein was detected in hyper- and metaplastic goblet cells of bronchi, bronchioli and trachea of COB- affected horses as well as in intraluminal mucins. A significant increase in eCLCA1-expressing goblet cells was identified by morphometrical analyses in bronchial and tracheal epithelia of COB-affected horses. No difference in the eCLCA1 mRNA expression level per single goblet cell was detected between COB- affected and unaffected horses by RT-qPCR following laser capture microdissection, suggesting that the increase in eCLCA1 expression is due to increased numbers of goblet cells, rather than transcriptional upregulation in the individual cell. Nevertheless, the more than two-fold increase of goblet cells secreting eCLCA1 under conditions of equine COB may still be consistent with a significant functional role of this molecule in COB. The results of this study are compatible with a primary pathogenic role of eCLCA1 in COB as well as with a secondary, possibly compensatory function, potentially due to increased hydration of the airway mucus by mediating calcium-activated chloride conductions. In addition to their model character for human asthma in which such a study is hard to perform, the results of this study set the stage for future investigations focused on the molecular function of eCLCA1.