Ballistomagnetischer Transfer von Nukleinsäuren in eukaryote Zellen

Abstract

Die Dissertation beschreibt ein Verfahren, mit dessen Hilfe Nukleinsäuren effektiv und einfach in Zellen eingebracht werden können. Dieses Verfahren beruht auf der Kombination von partikelvermittelter Transfektion mit magnetischer Zellsortierung. Im ersten Teil der Arbeit konnte durch Transfektion von kurzen fluoreszenzmarkierten Oligodesoxynukleotiden gezeigt werden, dass es mit dem Verfahren möglich ist, eine Population von Zellen zu isolieren, in der mehr als 90% der Zellen transfiziert sind. Durch Einbringen von "antisense"-ODN in die Zellen konnte gezielt eine G-Protein-Untereinheit ausgeschaltet werden. Am Modellsystem der eGFP-transfizierten Zelle konnte demonstriert werden, dass auch bei nachgewiesener antisense-Wirkung bei stark exprimierten Proteinen mit langer Halblebenszeit in der Zelle keine vollständige Unterdrückung der Genexpression erreichbar war. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Experimente mit Plasmid-basierten Genexpressionskonstrukten durchgeführt. Dabei stand die Frage im Vordergrund, wie viele Zellen tatsächlich nach der Transfektion das transfizierte Gen exprimieren. Besondere Gesichtspunkte dabei waren die quantitative Ermittlung der Anzahl der transferierten Plasmide und die Optimierung der Transfektionsmethode in Hinblick auf die Transfektionseffizienz. Dazu wurde eine quantitative PCR- Methode entwickelt, die für diese Fragestellung geeignet war. Anhand der Expression der Reportergene Luciferase und eGFP konnte nachgewiesen werden, dass mit dem Verfahren eine etwa zehnfache Erhöhung der Gesamtmenge an Proteinaktivität in der angereicherten transfizierten Zellpopulation bzw. des Anteils der exprimierenden Zellen an der Gesamtpopulation erreicht wurde. Das Verfahren stellt eine Erweiterung des Methodenspektrums der experimentellen und klinisch angewandten Molekularbiologie dar und wurde in einer klinischen Studie zur immuntherapeutischen Therapie des Nierenzellkarzinoms mit genmodifizierten Tumorzellen zur Anwendung gebracht.

The dissertation decribes a method for the efficacious transfection of eucaryotic cells with nucleic acids. This method is based on the combination of ballistic transfer and magnetic cell sorting. In the first part the enrichment of transfected cells was demonstrated by transfection of FITC coupled oligodeoxyribonucleotides (ODN). More than 90% of the enriched cell were transfected cells. The transfection of antisense ODN resulted in the complete supression of gene expression. In the second part of the dissertation cells were transfected with plasmid based expression vectors. The focus in this part was to determine parameters like amount of transfected vectors or optimization of the transfection method regarding transfection efficacy. For this purpose a quantitative PCR method was developed. The increase of the gene expression in the enriched fraction was determined with reporter genes like GFP or Luciferase and was in a range of 10. The transfection method is an improvement compared to the existing ballistic transfer and was used in clinical gene therapy trials against cancer.