Photosynthetic Water Oxidation in Plants and Cyanobacteria - Activation Energy of the O-O Bond Formation Step and Substrate Analogue NH3

Abstract

Photosynthetic water oxidation is a fundamental process that changed the atmosphere from an anaerobic to an aerobic one, first by cyanobacteria and then later on additionally by algae and plants. It is in the protein complex photosystem II (PSII) that oxygenic molecules are produced from water, driven by photoabsorption of solar radiation. The process is catalysed by a Mn- complex, the mechanism of which is still one of the unsolved questions. In this thesis, results on the mechanism of O-O bond formation in photosynthetic water oxidation by PSII are reported, specifically from the kinetic and energetic point of view. The investigations were performed experimentally using three time-resolved techniques established previously, which involve the excitation with sequence of light flashes (of nanosecond or microsecond duration) and detection of time courses typically in the time domain from about 10 µs to 500 ms that reflect functionally crucial processes in PSII. These techniques are: (1) variable PSII fluorescence (prompt chlorophyll fluorescence), (2) delayed (recombination) fluorescence of PSII, and (3) time- resolved oxygen polarography. Partial inhibition of oxygen evolving activity was found in both cyanobacterial and plant PSII using ammonia as a substrate analogue of water. Therefore, an anti-cooperative binding model was proposed for the first time wherein the ammonia binds at two different potential substrate water sites at the oxygen evolving complex (OEC). The model reconciles many aspects of the large body of experimental results on ammonia binding to PSII reported since 1975. The results of this study were published in the journal Biochemistry (Schuth, Liang et al., 2017). Investigation of the glycerol influence on the temperature dependence of PSII reactions revealed that, the activation enthalpy of O-O bond formation was significantly decreased in the presence of (30%) glycerol. In addition, the activation energy of O-O bond formation was compared among four PSII variants. A phenomenon of enthalpy-entropy compensation (EEC) of O-O bond formation was observed. A semi-quantitative model was newly proposed, that fits the experimental observation in EEC of both the wild-type and mutated PSII species, i.e. the non-local and local modification altered protein matrix, respectively. It explains the driving force of the EEC from the perspectives of the energy levels and probability in achieving a pre-transition state prior to the O-O bond formation. The model suggests that the experimentally observed enthalpy-entropy compensation may relate to evolutionary optimisation stability of the pre-transition state. A qualitatively similar explanation may be applicable to many other enzymatic processes.

Photosynthetische Wasseroxidation ist ein fundamentaler Prozess, der zunächst in Cyanobakterien und später auch in Algen und Pflanzen dazu führte, dass die einst anaerobe Atmosphäre in eine aerobe umgewandelt wurde. Ausgelöst durch die Absorption von Sonnenstrahlung, findet im Proteinkomplex Photosystem II (PSII) die Spaltung von Wasser in Sauerstoff und Protonen statt. Dieser Prozess wird von einem Mn-Komplex katalysiert, wobei der genaue Mechanismus eine bisher ungelöste Fragestellung darstellt. In der vorliegenden Arbeit werden neue Erkenntnisse zum Mechanismus der O-O-Bindungsbildung in photosynthetischer Wasseroxidation von einem kinetischen sowie energetischen Standpunkt aus vorgestellt. Die Untersuchungen wurden mittels drei verschiedener, bereits etablierten, zeitaufgelösten Methoden experimentell durchgeführt: (1) variable PSII Fluoreszenz (prompte Chlorophyllfluoreszenz), (2) verzögerte (Rekombinations-) Fluoreszenz und (3) zeitaufgelöste Polarographie. Alle drei Methoden beinhalten die Anregung mit einer Sequenz von Lichtblitzen (mit einer Dauer im Bereich von Nano- bzw. Mikrosekunden) und der zeitaufgelösten Detektion eines Signals, welches Informationen über einen für PSII wichtigen Prozess enthält. Die Detektion erfolgte jeweils über einen Zeitraum von etwa 10 µs bis 500 ms. Sowohl in cyanobakteriellem als auch in pflanzlichem PSII wurde eine partielle Inhibition der Sauerstoffproduktion festgestellt, wenn Ammoniak als Substratanalog für Wasser eingesetzt wird. In diesem Zusammenhang wurde zum ersten Mal ein anti-kooperatives Bindungsmodell vorgeschlagen, laut dem Ammoniak an zwei verschiedenen Bindungsstellen bindet, die potentielle Kandidaten für die Substratwasserbindung im Sauerstoff- produzierenden Komplex (OEC) darstellen. Das Modell bietet eine Erklärung für viele Aspekte der umfassenden experimentellen Ergebnisse zur Bindung von Ammoniak an PSII, welche seit 1975 Gegenstand der Forschung ist. Diese Ergebnisse wurden bereits im Biochemistry-Journal publiziert (Schuth, Liang et al., 2017). Untersuchungen zum Einfluss von Glycerin auf die Temperaturabhängigkeit der Reaktionen in PSII ergaben, dass die Aktivierungsenthalpie der Sauerstoffbindungsbildung mit der Zugabe von 30% Glycerin signifikant herabgesetzt wird. Zusätzlich wurde die Aktivierungsenergie der O-O-Bindungsbildung vier verschiedener PSII-Varianten verglichen, wobei das Phänomen der Enthalpie-Entropie-Kompensation (EEC) beobachtet wurde. Ein semi-quantitatives Modell formuliert, das eine Erklärung für die experimentellen Beobachtungen der EEC liefert. Dies gilt sowohl für die Ergebnisse verschiedener Wildtyp-PSII als auch mutierter PSII-Spezies, d.h. für nicht-lokale sowie lokale Modifikationen der Proteinmatrix. Das Modell erklärt die treibende Kraft der EEC aus der Perspektive von Energieniveaus und der Wahrscheinlichkeit, den Übergangszustand vor der O-O-Bindungsbildung zu erreichen. Zudem deutet das Modell auf die Möglichkeit hin, dass die observierte Enthalpie-Entropie-Kompensation eine Folge der evolutionären Stabilisierung des Übergangszustands sein könnte. Qualitativ ähnliche Erklärungen könnten auf zahlreiche andere enzymatische Prozesse anwendbar sein.