Mutationsanalyse der Zellzyklus-Kontrollpunktkinase Chk2 in humanen Tumorzelllinien: Bedeutung für Tumorgenese, -Biologie und Therapieresistenz

Abstract

Die Ansammlung von Mutationen und chromosomalen Veränderungen kennzeichnet die Entwicklung maligner Tumore. Defekte der zellulären Antwortprogramme auf DNA- Schäden begünstigen Onkogenese und beeinflussen Therapieansprechen und Prognose von Tumoren. Die Proteinkinase Chk2 (checkpoint kinase 2, Kontrollpunktkinase 2) ist ein zentraler Signalverteiler in der DNA- Schadenantwort. Sie reguliert die möglichen Zellantworten wie temporären Zellzyklusarrest, DNA-Reparatur, Seneszenz oder Zelltod durch Apoptose. Eine Bedeutung von Chek2 (das Chk2-kodierende Gen) als tumorkritisches Gen wurde für viele Gewebearten gezeigt. Fragestellung: In dieser Arbeit wurden humane Tumorzelllinien auf Mutationen in den kodierenden Abschnitten des Chek2-Gens untersucht. Das Ziel war zum einen Erkenntnisse zur Bedeutung von Chk2 in Onkogenese und Tumorbiologie zu gewinnen, und zum anderen diese häufig in Studien zur Tumorbiologie eingesetzten Zelllinien hinsichtlich zu berücksichtigender Chk2-Defekte zu charakterisieren. Material und Methoden: Untersucht wurden 47 Zelllinien von Kolonkarzinomen, Mammakarzinomen, Leukämien, Lymphomen und weiteren Tumorarten. Nach Extraktion der DNA wurden die interessierenden Abschnitte des Chek2-Gens durch Polymerasekettenreaktion amplifiziert und mittels Single-Strand Conformation Polymorphism Analyse (SSCP-Analyse) auf Mutationen gescreent. Auffällige Proben wurden zur Bestätigung und Spezifizierung sequenziert. Aufgrund der Existenz hochgradig homologer Pseudogene konnten nicht alle Chek2-Exons untersucht werden. Ergebnisse: In vier der untersuchten Tumorzelllinien wurden Mutationen gefunden. In der Kolonkarzinomlinie HCT-116 und der Mammakarzinomlinie MATU fand sich die heterozygot vorliegende Missense-Mutation L355P in Exon 9, die Kinasedomäne von Chk2 betreffend. Eine Version von HCT-116 zeigte zusätzlich eine heterozygote Basendeletion in Exon 8, ebenfalls in der Kinasedomäne. Die beiden bereits bekannten 2 heterozygoten Missense-Mutationen R145W in Exon 2 und A247D in Exon 5 in den Kolonkarzinomlinien HCT-15 und DLD-1 wurden bestätigt. Schlussfolgerung: Chek2-Mutationen treten in Tumoren eher selten auf und haben für sich allein eine geringe Bedeutung für die Onkogenese. Aufgrund der Komplexität und Parallelität der Signalwege hängt der Effekt eines einzelnen Defekts vom konkreten Mutationsstatus der übrigen Signalwegkomponenten ab. Bei der Verwendung von HCT-116 und anderer Tumorzelllinien als Modellsysteme für die Erforschung der DNA-Schadenantwort sollten Chek2-Mutationen berücksichtigt werden.

Background: The development of malignant tumours goes hand in hand with the accumulation of mutations and chromosomal aberrations. Defects in the cellular DNA damage response system promote oncogenesis and affect therapeutic response and prognosis of tumours. The protein kinase Chk2 (checkpoint kinase 2) plays a central role in signal distribution in the DNA damage response network. Chk2 regulates cellular processes like temporary cell cycle arrest, DNA repair, senescence or cell death through apoptosis. Chek2 (the gene encoding Chk2) was shown to be a cancer critical gene in many different tissue types. Objectives: This study analysed human cancer cell lines for mutations in the coding region of the Chek2 gene. The aim was to gain insights into the role of Chk2 in oncogenesis and tumour biology and to characterise these widely used cell lines in terms of relevant Chk2 defects. Material and Methods: 47 cancer cell lines of colon carcinomas, breast cancers, leukaemias, lymphomas and other tumour types were analysed for Chek2 mutations. After DNA extraction the relevant sections of the Chek2 gene were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and screened for mutations by single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP). Suspicious samples were sequenced for confirmation and specification of DNA alterations. Some Chek2 exons had to be excluded from the analysis due to highly homologous pseudogenes. Results: Mutations were found in four cancer cell lines. The heterozygous missense mutation L355P in exon 9 was found in the colon carcinoma cell line HCT-116 and in the breast cancer cell line MATU, affecting the kinase domain of Chk2. One version of HCT-116 additionally showed a heterozygous deletion of one base in exon 8, also affecting the kinase domain. The two previously reported missense mutations R145W in exon 2 and A247D in exon 5 in the colon carcinoma cell lines HCT-15 and DLD-1 were confirmed.