Optimizing the glycosylation of recombinant proteins

Abstract

Recombinant therapeutic glycoproteins, in particular the notably increasing demand and commercial relevance of antibodies, cytokines, hormones or coagulation factors, have emerged as a profitable but highly challenging sector of the pharmaceutical industry. Thereby, glycans, their monosaccharide composition and structural heterogeneity have fundamental and versatile impact on basic glycoprotein properties, such as protein folding, molecular stability, biological function, serum half-life or immunogenicity. Mammalian cell production platforms are currently the preferred systems for therapeutic glycoprotein manufacturing due to their natural ability to perform human-like glycosylation. Moreover, human expression hosts come to the fore throughout evading the synthesis of non-human glycan pattern and, in consequence, product antigenicity. Since the number of available human systems is presently limited and cell-type specific glycosylation characteristics attach further importance, the TE671 cell line was established as a novel tool for glycoprotein production within this work. Analyses of their membrane proteins and two recombinant model glycoproteins with therapeutical relevance, alpha-1-antitrypsin (A1AT) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), provided first insights into the glycosylation potential of this rhabdomyosarcoma cell line. An optimized method of cell transfection, the feasibility of cultivation under serum-containing and –free media conditions and, above all, the synthesis of complex and highly sialylated N-glycans characterized TE671 as a serious alternative to other existing human platforms. Highlighting the crucial importance of environmental impact factors on the final glycosylation profile, the novel term “glycoprotein species” was introduced within this work to join the definition of glycoforms (coined by Rademacher et al., 1988) with the concept of protein species (coined by Jungblut et al., 1996). Based on the analysis of their N-glycans, the theoretical numbers of glycoprotein species were determined for the therapeutic antibody trastuzumab and the serine protease inhibitor A1AT expressed in different cell lines in the presence and absence of serum. Regarding these low-complex examples, the resulting magnitude of structural heterogeneity was already much higher compared to other post-translational modifications and was primarily characterized by varying levels of terminal monosaccharides, such as fucoses and sialic acids. Thus, considering the aspect of glycoprotein species, in particular in process development and monitoring, is strongly suggested for future approaches in glycobiotechnology. Metabolic glycoengineering – the exogenous supply of unnatural metabolic precursor and their incorporation into glycoconjugates via salvage pathway – allows modulating the glycosylation of selected glycoproteins to improve protein quality or functional properties. Within this study, acylated fucose derivatives applied to a genetically engineered Chinese hamster ovary (CHO) cell line with blocked de novo fucose synthesis revealed an increase in fucosylation on cell membrane level and for the recombinant model antibody. A thus regulated gradual fucosylation of expressed trastuzumab could be shown to correlate with a reduced antibody’s binding affinity in a Fcγ receptor IIIa binding assay. Addressing the fucose bio-synthesis pathway by metabolic glycoengineering therefore can be considered as an appropriate strategy to directly influence glycosylation and, in consequence, functional aspects of recombinant glycoproteins. In summary, the goal of optimizing the glycosylation of recombinant model proteins was successfully realized by three independent approaches: the establishment of a novel human expression system on the basis of the rhabdomyosarcoma cell line TE671, the in-depth investigation of the impact of cell culture conditions on the number and occurrence of glycoprotein species, and the application of acylated fucose analogues in the course of metabolic glycoengineering. The respective publications of the applied promising techniques may prospectively contribute to improve the manufacturing of protein therapeutics with desired and defined glycan decoration.

Rekombinante, therapeutische Glykoproteine, insbesondere die beträchtlich wachsende Nachfrage und wirtschaftliche Bedeutung von Antikörpern, Zytokinen, Hormonen oder Gerinnungsfaktoren, haben sich als ein gewinnbringender aber in hohem Maße herausfordernder Zweig der pharmazeutischen Industrie entwickelt. Dabei haben Glykane, ihre Monosaccharid-Zusammensetzung und strukturelle Heterogenität wesentliche und vielseitige Bedeutung für grundlegende Eigenschaften von Glykoproteinen – wie Proteinfaltung, molekulare Stabilität, biologische Funktion, Serumhalblebenszeit oder Immunogenität. Säugerzell- Produktionssysteme sind derzeit bei der Herstellung therapeutischer Glykoproteine wegen ihres naturgegebenen Vermögens human-ähnliche Glykosylierung zu erzeugen, bevorzugt. Überdies rücken humane Expressionswirte in den Fokus, die die Synthese nicht-humaner Glykanstrukturen und folglich die Antigenität des Produktes gänzlich vermeiden. Da die Zahl verfügbarer humaner Systeme derzeit begrenzt ist und zudem Zelltyp-spezifischen Glykosylierungsmerkmalen Bedeutung zuzumessen ist, wurde im Rahmen dieser Arbeit die TE671-Zelllinie als neuartiges Werkzeug zur Glykoprotein- Herstellung etabliert. Die Analysen ihrer Membranproteine und zweier rekombinanter und therapeutisch relevanter Modellglykoproteine, Alpha-1-Antitrypsin (A1AT) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), lieferten erste Erkenntnisse bezüglich des Glykosylierungspotentials dieser Rhabdomyosarkom-Zelllinie. Eine optimierte Zelltransfektion, die Kultivierbarkeit unter serumhaltigen und –freien Medienbedingungen und vor allem die Synthese von vornehmlich komplexen, hoch- sialylierten N-Glykanen zeichneten TE671 als ernstzunehmende Alternative zu anderen existierenden humanen Plattformen aus. Um die entscheidende Bedeutung der umgebungsbedingten Einflussfaktoren auf das finale Glykosylierungsprofil hervorzuheben, wurde der neuartige Begriff „Glykoprotein-Spezies“ im Rahmen dieser Arbeit eingeführt, um die Definition von Glykoformen (geprägt durch Rademacher et al., 1988) mit dem Konzept der Protein-Spezies (geprägt durch Jungblut et al., 1996) zu verbinden. Basierend auf der Analyse ihrer N-Glykane wurde die theoretische Anzahl an Glykoprotein-Spezies für den therapeutischen Antikörper Trastuzumab und den Serinprotease-Inhibitor A1AT, die in verschiedenen Zelllinien in An- und Abwesenheit von Serum exprimiert wurden, bestimmt. Bereits hinsichtlich dieser wenig komplexen Beispiele war das resultierende Ausmaß der strukturellen Heterogenität viel größer im Vergleich zu anderen posttranslationalen Modifikationen und zeichnete sich vorrangig durch verschiedene Anteile terminaler Monosaccharide, wie Fucosen und Sialinsäuren, aus. Demnach wird dringend empfohlen, den Aspekt der Glykoprotein-Spezies, insbesondere in der Prozessentwicklung und –überwachung, in zukünftigen Ansätzen in der Glykobiotechnologie zu berücksichtigen. Metabolisches Glycoengineering – die exogene Zuführung von unnatürlichen metabolischen Vorläufern und ihr Einbau in Glykokonjugate über den Salvage-Weg – erlaubt die Glykosylierung ausgewählter Glykoproteine zu modulieren, um ihre Proteinqualität oder funktionelle Eigenschaften zu verbessern. Im Rahmen dieser Studie zeigten acylierte Fucose-Derivate am Beispiel einer gentechnisch veränderten Chinese hamster ovary (CHO)-Zelllinie eine Steigerung der Fucosylierung auf Zellmembran-Ebene und für den rekombinanten Modellantikörper. Für eine auf diese Weise gesteuerte, graduelle Fucosylierung von exprimiertem Trastuzumab konnte eine Korrelation mit gesenkter Bindungsaffinität des Antikörpers in einer Fcγ-Rezeptor IIIa-Bindungsstudie gezeigt werden. Die Adressierung des Fucose-Biosyntheseweges durch metabolisches Glycoengineering kann daher als eine zweckdienliche Strategie betrachtet werden, um die Glykosylierung, und folglich funktionale Aspekte von rekombinanten Glykoproteinen, zielgerichtet zu beeinflussen. Das Ziel der Optimierung der Glykosylierung rekombinanter Modellproteine wurde somit durch drei unabhängige Ansätze erfolgreich umgesetzt: die Etablierung eines neuartigen humanen Expressionssystems auf Grundlage der Rhabdomyosarkom- Zelllinie TE671, die detaillierte Untersuchung des Einflusses von Zellkulturbedingungen auf die Zahl und Ausprägung von Glykoprotein-Spezies und die Anwendung von acylierten Fucose-Analoga im Zuge des metabolischen Glycoengineerings. Die entsprechenden Publikationen der angewendeten, aussichtsreichen Techniken können zukünftig einen Beitrag leisten, die Herstellung von Proteintherapeutika mit erwünschter und definierter Glykanausstattung zu verbessern.