The impact of the transcription factor MAF on physiology and malignant transformation in terminal B cell differentiation

Abstract

Multiple myeloma is a tumor of terminally differentiated B cells, i.e., plasma cells (PCs), and arises in the bone marrow (BM). Initial genetic events are acquired during the germinal center (GC) reaction of B cells. In approx. 50 % of cases, translocations that juxtapose oncogenes to the immunoglobulin heavy-chain enhancers lead to their respective overexpression and initiate transformation. Next to cyclin D members and MMSET, overexpression of three MAF transcription factors is found, most commonly c-MAF due to the translocation t(14;16). Previous work by our group therefore aimed to overexpress Maf in mouse GC B cells to model myeloma initiation in Cγ1-cre; R26 MafstopF mice. Unexpectedly, B cell-specific overexpression of Maf led to a dramatic reduction and counter-selection of Maf-expressing GC B cells upon immunization with a thymus-dependent antigen, whereas IgM-expressing antigen-specific PC accumulated in the BM. To characterize the altered GC reaction upon Maf overexpression, the present work examined the proliferation, T cell support, and immunosurveillance of Maf-transgenic GC B cells by BrdU incorporation and flow cytometry of splenic cell populations, respectively. The timing-dependent impact of Maf overexpression on early, peak, late GC B cells and their progeny was investigated in Cγ1-creERT2; R26 MafstopF mice, which allowed for specific Maf transgene expression at distinct time points following immunization. The protein interactome of MAF was assessed by immunoprecipitation and mass spectrometric analysis of coprecipitated proteins in human t(14;16)+ multiple myeloma cell lines. The Cγ1creERT2; R26 MafstopF allele used here, allowed for the overexpression of Maf at different stages of terminal B cell differentiation and the study of the corresponding effects in mice. Delayed transgene expression in peak GC B cells mitigated the counter-selection of Maf-expressing GC B cells and was compatible with class switch recombination and differentiation into BMPCs. A reduction of Maf-expressing B cell populations was observed regardless of the timepoint of Maf overexpression. Impaired proliferation of GC B cells, limited T cell support, or immune surveillance were not causative factors. Proteomic analyses showed that oncogenic MAF interacts with a variety of transcription factors, in particular with members of the NFKB and RUNX families. For the future investigation of the cooperation between MAF and putative interactors, an in vitro screening system was established based on retroviral overexpression of candidate interaction partners in Maf-transgenic mouse B cells, using expression analysis of the MAF target gene Itgb7 as read-out for transcriptional activity. Taken together, the results obtained in this work will contribute to the improvement of future mouse models for the t(14;16) translocation, with the goal of developing new therapies.

Das Multiple Myelom ist ein Tumor maligner Plasmazellen und tritt im Knochenmark auf. Initiale genetische Ereignisse entstehen in B-Zellen während der Keimzentrumsreaktion. In ca. 50 % der Fälle führen Translokationen zur Überexpression spezifischer Onkogene durch die Anlagerung jeweiliger Loci an die Enhancerregion der schweren Immunglobulinkette. Neben Cyclin-D-Mitgliedern und MMSET findet sich die Überexpression dreier MAF-Transkriptionsfaktoren, am häufigsten von c-MAF als Folge der Translokation t(14;16). Frühere Arbeiten unserer Gruppe beabsichtigen, Maf in Keimzentrums-B-Zellen der Maus zu überexprimieren, um die Myelom-Entstehung in Cγ1-cre; R26 MafstopF-Mäusen zu modellieren. Die B-Zell-spezifische Überexpression führte jedoch zu einer dramatischen Gegenselektion Maf-exprimierender Keimzentrums-B-Zellen nach Immunisierung, während IgM-exprimierende antigenspezifische Plasmazellen im Knochenmark akkumulierten. Um die veränderte Keimzentrumsreaktion bei Maf-Überexpression zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Arbeit Proliferation, T-Zell-Unterstützung und Immunüberwachung Maf-transgener Keimzentrums-B-Zellen durch BrdU-Inkorporation und Durchflusszytometrie entsprechender Zellpopulationen untersucht. Die Auswirkung der Maf-Überexpression auf frühe, mittlere und späte Keimzentrums-B-Zellen und ihre Nachkommen wurden durch gezielte Transgenaktivierung in Cγ1-creERT2; R26 MafstopF-Mäusen untersucht. Weiterhin wurde das Protein-Interaktom von MAF durch Immunpräzipitation und Massenspektrometrie in humanen t(14;16)+ Myelom-Zelllinien untersucht. Das hier verwendete Cγ1creERT2; R26 MafstopF-System ermöglichte die Überexpression von Maf in verschiedenen Stadien der terminalen B-Zell-Differenzierung der Maus und die Untersuchung entsprechender Auswirkungen. Eine verzögerte Maf-expression in Keimzentrums-B-Zellen verringerte die Gegenselektion Maf-exprimierender Keimzentrums-B-Zellen und war mit dem Klassenwechsel und der Differenzierung zu Knochenmark-Plasmazellen vereinbar. Unabhängig vom Zeitpunkt der Maf-Überexpression wurde eine Verringerung Maf-exprimierender B-Zellpopulationen beobachtet. Eine beeinträchtigte Proliferation von Keimzentrums-B-Zellen, eingeschränkte T-Zell-Unterstützung oder Immunüberwachung waren nicht ursächlich. Proteomanalysen zeigten, dass MAF mit einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren interagiert, vor allem mit Mitgliedern der NFKB und RUNX Familie. Um die Kooperation zwischen MAF und potenziellen Interaktoren zu untersuchen, wurde ein Screening etabliert, das auf der retroviralen Überexpression von Kandidatengenen in Maf-transgenen Maus-B-Zellen basiert und die transkriptionelle Induktion des MAF-Zielgens Itgb7 als Parameter verwendet. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse werden zur Verbesserung künftiger Mausmodelle für die Translokation t(14;16) beitragen, mit dem Ziel der Entwicklung neuer Therapien.