Aufbau einer Apparatur zur zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung an Synchrotronstrahlungsquellen: Dynamik und Ordnung ortsspezifisch an der Oberfläche der Membranproteine Bacteriorhodopsin und Rinderrhodopsin gebundener Fluorophore

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Meßapparatur zur zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung für den Einsatz an Synchrotronstrahlungsquellen entwickelt und zum Einsatz gebracht. Mit dem neuen Meßaufbau wurden Experimente zur zeitaufgelösten Fluoreszenzanisotropie von an den Membranproteinen Bacteriorhodopsin und Rinderrhodopsin gebundenen Fluoreszenzmarkern (Labeln) durchgeführt. Die sulfhydrylreaktiven Fluoreszenzmarker wurden ortsspezifisch an verschiedene Positionen innerhalb der die Transmembranhelices verbindenden Schleifenkonformationen (Loops) gebunden, um die Dynamik und die sterische Beschränkung dieser flexiblen Bereiche zu studieren. Es sollte ein Verständnis für das Bewegungsverhalten der Fluoreszenzmarker unter der Beteiligung der flexiblen Polypeptidketten entwickelt werden.

Die empirische Anpassung der gemessenen zeitaufgelösten Fluoreszenzanisotropiekurven erfolgte mit einer Summe von ein bis drei Exponentialfunktionen. Die Kurzzeitkomponente von einigen Hundert Pikosekunden wurde der Eigenbewegung der Fluorophore zugeordnet. Die mittlere Zeitkomponente von einigen Nanosekunden wurde als Anteil der Loops interpretiert. Die Langzeitkomponente von einigen zehn Nanosekunden bei den Mizellen beruhte auf der Depolarisation durch die Gesamtrotationsdiffusion.

Neben der Rotationsdiffusion trat bei einer Reihe von markierten Proteinproben zusätzlich strahlungsloser Energietransfer auf. Der strahlungslose Transfer der Energie vom Fluoreszenzmarker (Donator) zum Retinal-Chromophor (Akzeptor) führte zu keinen signifikanten Veränderungen des Anisotropieverlaufs. Der Energie-Homotransfer der Donatoren untereinander führte dagegen zu einer verstärkten Depolarisation. Mit Hilfe des Energietransfers konnten für verschiedene Positionen Abstandsbereiche zwischen den Transferpartnern berechnet werden.

Gleichlichtexperimente zur Polarität der Labelumgebung sowie Quenchingexperimente mit Jodionen wiesen auf eine freie Zugänglichkeit und ein wäßriges Umgebungsmilieu der gebundenen Fluoreszenzmarker hin.

Ein wesentliches Resultat dieser Arbeit war der direkte Nachweis von Konformationsänderungen an der zytoplasmatischen Oberfläche des Rhodopsins mit Hilfe der Methode der zeitaufgelösten Fluoreszenzanisotropie. Die Experimente zum Anisotropieverhalten im Grundzustand und im aktiven Intermediatszustand MII führten zu der Beobachtung einer Erhöhung des Ordnungsparameters durch die Photoaktivierung. Dieser Effekt an den Positionen C316 und C140 wurde als eine Erhöhung der sterischen Bewegungsbeschränkung der Label-Loop-Konstrukte im aktiven MII-Zustand interpretiert.

A new optical set up was developed for the time-correlated single photon counting using synchrotron radiation for excitation. With this new set up time-resolved fluorescence anisotropy experiments were executed. The sulfhydryl reactive fluorescence markers were specifically bound at different positions within the loops, connecting the helices of the membrane proteins bacteriorhodopsin and bovine rhodopsin., in order to study the dynamics and the sterical restriction of these flexible polypeptide chains.

For the empirical analysis of the measured time-resolved fluorescence anisotropy curves a sum of one to three exponential functions was used. The short time component of some hundred picoseconds was assigned to the independent movement of the fluorophores. The middle time component of some nanoseconds was caused by the loops. The long-term component of some ten nanoseconds was based on the depolarization by total rotation diffusion of the micelle systems.

Apart from rotation diffusion additionally the process of radiationless energy transfer occurred at the marked protein samples. The radiationless transfer of the energy of the fluorescence marker (donor) to the retinal chromophor (acceptor) led to no significant modifications of the anisotropy process. The energy homotransfer of the donors among themselves led against it to an intensified depolarization. With the help of the energy transfer distance ranges between the transfer partners could be calculated for different positions.

Experiments to test the polarity of the label environment as well as fluorescence quenching with iodine ions referred to a free accessibility and an aqueous environment of the bound fluorescence markers.

A substantial result of this work was the direct proof of conformational changes at the cytoplasmic surface of the rhodopsin by the method of the fluorescence anisotropy. The experiments to the anisotropy behaviour in the initial state and in the active intermediate state MII led to the observation of an increase of the order parameter by the photo activation. This effect at the positions C316 and C140 was interpreted as an increase of the sterical restriction of the label-loop-construction in the active state.