Systematic search for microRNA regulated target genes with roles in the etiology of periodontitis

Abstract

This thesis showed the target genes and gene sets of the 7 miRNAs that were upregulated in periodontal inflammation. These miRNAs regulate cytokine signaling, cell cycle and division and downregulate the periodontitis risk genes CPEB1, ABCA1 and ATP6V1C1. Additionally, all of the selected miRNAs significantly upregulated the gene MET Proto-Oncogene, Receptor Tyro-sine Kinase (MET). This indicated indirect regulation by most miRNAs, occurring upstream in the different signaling cascades, which would converge downstream to increased MET expression, as observed in my experiments. This argues for a relevant role of MET in the disease etiology, particularly during the stage when the gingival tissue biopsies were collected. To prove this finding, I validated the RNA-Seq data by qRT-PCR as an alternative technical method. Addi-tionally, I re-transfected each miRNA separately and performed protein blotting, which proved increased MET expression after miRNA transfection on the protein level. Moreover, within this thesis, miRNA hsa-miR-130a-3p was identified as a transcriptional re-pressor of the gene CPEB1, an essential component for successful mitotic cell division. CPEB1, along with CPEB4, encoded by another periodontitis risk gene, plays a crucial role in the phase-specific polyadenylation and translational activation of CPE-regulated transcripts during the mitotic cell cycle. This thesis provided mechanistic evidence demonstrating that increased expression of hsa-miR-130a-3p leads to reduced transcript levels and protein activity of a reporter gene expressing the CPEB1 3'UTR. The molecular mechanism underlying this effect was shown to be consistent across different cell types, as observed in Immortalized Human Gingival Fibroblasts and Primary Human Gingival Fibroblasts. In conclusion, these experiments revealed that hsa-miR-130a-3p interacts with the 3' UTR of CPEB1, resulting in gene expression suppression through mRNA degradation. However, to gain a comprehensive understanding of the regulatory mechanisms involving the MET gene, it is imperative to conduct additional investigations that delve into both its upstream and downstream regulatory pathways. This aspect represents a notable limitation of the present study, as the direct regulatory pathways preceding the gene MET, as well as the subsequent pathways it influences, require further exploration. By addressing this limitation, future research endeavors can unravel the intricate network of regulatory factors governing the gene MET and provide a more comprehensive picture of its functional implications.

Ziele. Mehrere arraybasierte miRNA-Expressionsstudien haben unabhängig voneinander eine erhöhte Expression der miRNA hsa-mir-130a-3p, -142-3p, -144-3p, -144-5p, -223-3p, -17-5p und -30e-5p im entzündeten Zahnfleisch von Patienten mit Parodontitis im Vergleich zu gesunden Kontrollen gezeigt. Unser Ziel war es, direkte Zielgene und Signalwege zu bestimmen, die durch diese miRNAs reguliert werden. Material und Methoden. Wir transfizierten einen miRNA-Mimetikum (mirVana) jeder miRNA in Kulturen humaner primärer Zahnfleischfibroblasten, die aus dem Zahnfleisch von drei verschiedenen Spendern isoliert wurden. Nach RNA-Sequenzierung wurde die differentielle Genexpression mit DESeq2 analysiert. Die Analyse der Anreicherung verschiedener Gen-Sets erfolgte mit MSigDB, den tmod- und goseq-Paketen. Die Hemmung und Hochregulierung der miRNAs wurden auf der Transkript- und Proteinebene mit quantitativer RT-PCR, Western-Blotting und Reporter-Gen Assays validiert. Ergebnisse. Die Gen-Set-Anreicherung zeigte signifikante Rollen für die Regulation des Zellzyklus von hsa-miR-130a-3p (Padj=5x10-15), miRNA-144-3p und -5p (Padj=4x10-40 und Padj=4x10-6), miR-17-5p (Padj=9.5x10-23) und miR-30e-5p (Padj=8.2x10-18). Darüber hinaus wurden signifikante Rollen in der Zytokinsignalgebung für miR-130a-3p (Padj=5x10-15), miR-223-3p (Padj=2.4x10-7) und miR-142-3p (Padj=5x10-11) gezeigt. Die Gene WASL, ENPP5, MANBAL, IDH1 zeigten die signifikanteste und stärkste Inhibition nach der Transfektion von hsa-miR-142-3p, -17-5p, -223-3p und -30e-5p, respektive. Darüber hinaus regulierten hsa-miR-130a-3p, -144-3p und -144-5p die Parodontitisrisikogene CPEB1, ABCA1 und ATP6V1C1. In unserer Studie zeigte die Expression aller analysierten miRNAs eine signifikante positive Korrelation mit der Expression des Gens MET, das an der Wundheilung sowie an der Geweberegeneration und -umgestaltung beteiligt ist. Schlussfolgerung. Die differentielle Expression von Gen-Sets der Zytokinsignalgebung und der Regulation der Zellproliferation nach Überexpression der untersuchten miRNAs weist auf ihre Bedeutung für die Ätiologie der Parodontitis hin. Darüber hinaus liefert die Identifikation der Parodontitisrisikogene CPEB1, ABCA1 und ATP6V1C1 als Zielgene einiger der untersuchten miRNAs weitere Hinweise für ihre Bedeutung in der Ätiologie der Parodontitis. Gingivale miRNAs führen komplexe regulatorische Netzwerke derart zusammen, dass sie zu einer verstärkten Expression des Gens MET führen. Dies betont die Bedeutung von MET, einem Rezeptor des fibroblastensezernierten mitogenen Hepatozytenwachstumsfaktors, für das Krankheitsgeschehen im Anschluß an die aktive orale Entzünung.