Dendritic Polyglycerolsulfate Micelles for the Targeted Delivery of Chemotherapeutics

Abstract

This thesis aimed to investigate dendritic polyglycerolsulfate as a replacement for PEG in the construction of targeted drug delivery systems. For the design, functional amphiphilic block copolymer micelles were desired with defined molecular weight ratios between the hydrophilic and the hydrophobic segments. Additionally, this work investigated the influence on the stability dictated by the core-forming polymer's nature by employing different cohesive forces to the core segment, including hydrophobic and π–π interactions. To our understanding, a low CMC is an indispensable criterium for the clinical application of self-assembled systems; thus, the goal was to obtain highly stable drug-delivery micelles that resist high dilution in the patient´s bloodstream. The in vitro cell compatibility, in vivo therapeutic efficacy, safety, and biodistribution were investigated in suitable cell and animal models as a final proof of concept.

In the first project, well-defined dPGS-SS-PCL/PLA/PLGA amphiphilic block copolymers were prepared by organo-catalyst-mediated ROP of the respective monomers caprolactone, lactide, and lactide/glycolide forming the hydrophobic block; aROP of glycidol followed by amide coupling of cysteamine gave the hydrophilic segment (dPG-SS-NH2). Finally, amide coupling of these blocks and subsequential sulfation acquired the functional amphiphilic block copolymers with defined molecular weight ratios. The morphology, size, surface charge, and, most importantly, their stabilities were systematically analyzed using cryo-EM and light scattering techniques. The spherical particles showed monodispersed size distributions in the 81−187 nm range, strong negative charges between −52 and −41 mV, and low critical micelle concentrations (CMCs) of up to 1.13−3.58 mg/L (134−527 nM). As the model drug, Sunitinib was chosen, which could be successfully encapsulated in the carriers, finding drug-loading efficiencies of 38 to 83% (8−17 wt%). The selective drug release was proven in both in vitro and in vivo studies. The serum protein interaction and stability in the presence of HSA, the most abundant serum protein, was studied by light scattering and fast protein liquid chromatography (FPLC), revealing neither interaction nor disassembly of the carriers (serum stability 24 h: 94%). Compared to the nonsulfated dPG-SS-PCL-Et micelles, their sulfated analogs enabled the substantial accumulation of the carrier systems in the cancerous tissue (tumor and metathesis) in an HT-29 tumor-bearing mice. The detection of the fluorophore in the cancerous tissue after even seven days upon administration points to a prolonged release profile of these carriers, suggesting that the micelles could serve as a kind of depot for the drug. The sustained release profile was also indicated by in vitro drug release experiments simulating the environment of cancer cells by adding glutathione (GSH) and enzymes (surface-immobilized lipase), showing 85% drug release after four days with low leaching of only 20%. For testing the therapeutic efficacy and safety of the dPGS-SS-PCL-Et micelles, an HeLa-tumor-bearing mice model was established, and the mice were treated with (i) PBS serving as control; (ii) free Sunitinib which was applied daily in the first 12 days in concentrations of 40 mg/kg for each injection (twelve injections each cSunitinib = 40 mg/kg = 480 mg/kg; 1 equiv.); and (iii) dPGS-SS-micelle-encapsulated Sunitinib was administered on days 1, 4, 7, 10, and 13 with a reduced drug concentration of 10 mg/kg for each injection (five injections each cSunitinib = 10 mg/kg = 50 mg/kg; 0.1 equiv.). After 40 days, no tumor growth inhibition was detected for PBS, resulting in a tumor size of 947 mm3 from an initial size of 71 mm3 (total growth rate: 1,333%). Free Sunitinib inhibited the tumor growth as the size after 40 days was 421 mm3 (total growth rate: 592%). However, for the micelle-supported treatment with a 10-fold lower drug dosage, the total growth rate was successfully decreased to 523%, final size: 372 mm3). Also, the prolonged release profile was observed, as the tumor growth was suppressed until day 30, or 17 days after the last injection. Further, neither the administration of PBS nor free Sunitinib had adverse effects on the body weight or the tissue of the mice's organs, such as the heart or liver, and so did the dPGS-SS-micelles therapy. Thus, dPGS could successfully enhance the therapeutic potential with no adverse side effects to the organism.

In the second project, the hydrophobic segment was changed to recently published poly(ester amide)s, so-called N-Acylated-1,4-oxazepan-7-ones (OxP), enabling the straightforward preparation of polymers with a tailored number of aromatic moieties in their sidechain. This modification aimed to answer whether the stability of the systems from project 1 can be further increased to boost their therapeutic potential. For this, the intrinsic targetability of dendritic polyglycerolsulfate toward cancerous tissue was combined with π-electron stabilization, which has already proven its great potential in clinically tested candidates. To understand the influence of π-electron-rich domains on stability, a library of three different amphiphilic block copolymers with varying π-electron density was designed, including (i) with no π -electrons (dPGS-SS-PCL-Et); (ii) with π-electrons located on the chain end (dPGS-SS-PCL-Py); and (iii) with π -electron distributed along the hydrophobic polymer block (dPGS-SS-POxPPh-Py). Again, the morphology, size, and surface charge were systematically analyzed using cryo-EM and light scattering techniques. The spherical particles showed monodispersed size distributions in the 81−129 nm range, with strong negative charges between −44 and −34 mV. Quantitatively light scattering experiments show extremely low critical micelle concentrations (CMCs) of up to 0.3−2.1 mg/L (18−133 nM), which is 55-fold lower than conventional block copolymer micelles. Additional studies by UV-VIS, Fluorescence, and solid-state 13C Cross-Polarization NMR proved the presence of π-π interactions in the aromatic micellar core between the polymer chains and the cargo, pointing to a substantial contribution of these noncovalent interactions to the system’s high stability. Also, the micelles are stable under physiological conditions with no blood serum protein absorption on their surface after four days. The precise in vitro degradation by reductive and enzymatic cleavage is analyzed using light scattering and gel permeation chromatography (GPC) experiments. The high potency of inhibiting cancer cell growth by the DTX-formulations on different tumor-derived cell lines also points to the selective drug release in cancerous tissue, revealing half-maximal inhibitory concentrations (IC50) efficiently reduced to 68 nM. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) monitored the successful cell insertion of the micelles by fluoresceine-labeled FITC-dPGS-SS-POxPPh-Py. All in all, this study allows more profound insights into the conception of drug delivery systems, starting at their synthesis, continuing with the systematic screening of their stability, understanding their molecular self-assembly, and finally, in vitro performance regarding cellular uptake, cell tolerability, and cancer growth inhibition. Further, it demonstrates that implementing π-electron rich domains into self-assembled dPGS-SS-polymeric micelles holds great potential as drug delivery platforms.

This thesis has emphasized the potential of dPGS-SS-micelles for being a key figure in replacing PEG-containing carriers in drug delivery applications. The sulfation of the amphiphilic block copolymer scaffold had a tendinous impact on the biodistribution and has resulted in selective accumulation of the dPGS-micellar systems in the cancerous tissue with no accumulation in healthy tissue. Further, for the dPGS-SS-micelle-supported treatment, the required drug dosage to inhibit the tumor growth was efficiently reduced by 10-fold compared to administrating the free drug, minimizing undesired side effects on the worn-out patients. By employing π–π interactions to the micellar core, the stability was increased to CMCs in the range of 0.3 mg/mL, 55-fold lower than that of conventional micellar systems.

For future investigations, it is crucial to understand the underlying cancer-targeting mechanism of dPGS-functionalized systems. Several techniques, such as isothermal titration calorimetry (ITC) or microscale thermophoresis (MST), have already been established for comparable systems, enabling the detection of intermolecular interactions of the polymer with another (bio)macromolecule of interest. Also, the immunogenicity and antigenicity of dPGS systems have yet to be studied; for PEG, anti-PEG IgG and IgM antibodies are the main antagonists for the immune response. After the worldwide vaccination campaign to defeat the COVID-19 pandemic, this problem will certainly become even more prominent. To answer this question, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or surface plasmon resonance (SPR) experiments should be performed to detect possible interactions of these antibodies with the polymer. All these experiments must be conducted concerning the physiological conditions in the bloodstream and the cancer cell environment. Regarding the polymer design, the installment of chemical crosslinking to the core and the drug should be considered, as these systems can completely overcome leaching events or disassembly in the bloodstream. Another critical aspect tackles the availability and supply of these drug delivery systems. Again, the COVID-19 pandemic revealed another bottleneck: the challenges of cold chain supplies. Therefore, the freeze-drying process of these medications must be studied to ensure a constant and cost-effective supply. The knowledge of already market-authorized lyophilized nanoformulations can most likely be exploited for dPGS-SS-micelles; core-crosslinking also has shown to be beneficial in the free-drying process.

Das Ziel dieser Arbeit war es, dendritisches Polyglycerolsulfat als Ersatz für PEG bei der Konstruktion zielgerichteter Arzneimittelabgabesysteme zu untersuchen. Für das Design wurden verschiedene funktionelle amphiphile Blockcopolymermicellen, mit jeweils wohl definierten Molekulargewichtsverhältnissen zwischen den hydrophilen und den hydrophoben Segmenten, synthetisiert. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit der Einfluss des kernbildenden Polymers auf die Stabilität untersucht, indem verschiedene Kohäsionskräfte in das Kernsegment eingebettet wurden, darunter waren sowohl hydrophobe als auch π-π-Wechselwirkungen. Unserem Verständnis nach ist eine niedrige kritische Micellenkonzentrationen (engl. CMC) ein unverzichtbares Kriterium für die klinische Anwendung von selbstorganisierten Systemen. Aus diesem Grund war es das Ziel, stabile Mizellen für die Medikamentenabgabe zu erhalten, die einer hohen Verdünnung im Blutkreislauf des Patienten standhalten. Die in vitro Zellkompatibilität, die in vivo Therapiewirksamkeit, die Pharmakodynamik (engl. Safety) und die Biodistribution wurden in geeigneten Zell- und Tiermodellen untersucht, um einen endgültigen Konzeptnachweis zu erbringen.

Im ersten Projekt wurden wohldefinierte amphiphile dPGS-SS-PCL/PLA/PLGA-Blockcopolymere durch Organokatalysator-vermittelte Ringöffnende Polymerisation (engl. ROP) der jeweiligen Monomere Caprolacton, Lactid und Lactid/Glycolid hergestellt, die jeweils den hydrophoben Block bildeten. Anionische Ringöffnende Polymerisation (engl. aROP) von Glycidol, gefolgt von einer Amidkopplung von Cysteamin, ergab das hydrophile Segment (dPG-SS-NH2). Die Amidkopplung dieser beiden Blöcke und die anschließende Sulfatierung ergaben schlussendlich die funktionellen amphiphilen Blockcopolymere mit definierten Molekulargewichtsverhältnissen. Die Micellen wurden hinsichtlich ihrer Morphologie, Größe, Oberflächenladung und vor allem ihrer Stabilität systematisch mit Hilfe von Kryo-EM und Lichtstreuungstechniken untersucht. Die sphärischen Partikel wiesen monodisperse Größenverteilungen im Bereich von 81-187 nm, starke negative Ladungen zwischen -52 und -41 mV und niedrige kritische Micellenkonzentrationen (engl. CMC) von bis zu 1,13-3,58 mg/L (134-527 nM) auf. Als Modellarzneimittel wurde Sunitinib ausgewählt, das erfolgreich in die Träger eingekapselt werden konnte, wobei eine Beladungseffizienz von 38 bis 83 % (8-17 Gew.-%) erreicht wurde. Die selektive Wirkstofffreisetzung wurde sowohl in in vitro als auch in in vivo Studien nachgewiesen. Die Interaktion und Stabilität der Wirkstoffträgersysteme in Anwesenheit von HSA, dem häufigsten Serumprotein, wurde mittels Lichtstreuung und schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (engl. FPLC) untersucht, wobei weder eine Interaktion mit dem Protein noch das Auseinanderfallen der Wirkstoffträger festgestellt wurde (Serumstabilität 24 h: 94 %). Im Vergleich zu den nicht sulfatierten dPG-SS-PCL-Et Micellen ergaben ihre sulfatierten Analoga eine beträchtliche Anreicherung der Trägersysteme im Krebsgewebe (Tumor und Metathese) von Mäusen, die einen HT-29-Tumor trugen. Der Nachweis des Fluorophors im Krebsgewebe deutete sogar noch sieben Tage nach der Verabreichung auf ein verlängertes Freisetzungsprofil dieser Trägersysteme hin, was wiederum darauf hinwies, dass die Micellen als eine Art Depot für den Wirkstoff dienen könnten. Das verlängerte Freisetzungsprofil wurde auch durch in vitro Experimente, welche auf die gezielte Wirkstofffreisetzung abzielten, nachgewiesen. Bei diesen Experimenten wurde die Umgebung von Krebszellen durch die Zugabe von Glutathion (GSH) und Enzymen (oberflächenimmobilisierte Lipase) simuliert. Dabei wurde eine Wirkstofffreisetzung von 85 % nach vier Tagen bei einem geringen Wirkstoffverlust von nur 20 % beobachtet. Um die therapeutische Wirksamkeit und Verträglichkeit der dPGS-SS-PCL-Et Micellen zu testen, wurde ein HeLa-Tumor-tragendes Mausmodell etabliert, und die Mäuse wurden mit folgenden Therapien behandelt: (i) PBS diente als Kontrolle; (ii) freies Sunitinib, das in den ersten zwölf Tagen täglich in einer Konzentration von 40 mg/kg mit jeder Injektion verabreicht wurde (zwölf Injektionen je cSunitinib = 40 mg/kg = 480 mg/kg; 1 Äquiv. ); und (iii) dPGS-SS-Micelle verkapseltes Sunitinib wurde an den Tagen 1, 4, 7, 10 und 13 mit einer reduzierten Wirkstoffkonzentration von 10 mg/kg bei jeder Injektion verabreicht (fünf Injektionen je cSunitinib = 10 mg/kg = 50 mg/kg; 0,1 Äquiv.). Nach 40 Tagen wurde durch die Injektion von PBS keine Hemmung des Tumorwachstums festgestellt, was zu einer finalen Tumorgröße von 947 mm3 bei einer Ausgangsgröße von 71 mm3 führte (Gesamtwachstumsrate: 1.333 %). Freies Sunitinib hingegen hemmte das Tumorwachstum, da die Größe nach 40 Tagen 421 mm3 betrug (Gesamtwachstumsrate: 592 %). Bei der micellengestützten Behandlung mit einer 10-fach geringeren Wirkstoffdosis wurde die Gesamtwachstumsrate erfolgreich auf 523 % gesenkt (Endgröße: 372 mm3). Außerdem wurde ebenfalls das verlängerte Freisetzungsprofil beobachtet, da das Tumorwachstum bis zum 30. Tag, also 17 Tage nach der letzten Injektion, unterdrückt wurde. Darüber hinaus hatte weder die Verabreichung von PBS noch von freiem Sunitinib nachteilige Auswirkungen auf das Körpergewicht oder das Gewebe der Mäuseorgane wie Herz oder Leber. Diese Beobachtung trifft ebenfalls auf die dPGS-SS-Micellen Therapie zu. Somit konnte dPGS das therapeutische Potenzial erfolgreich und ohne nachteilige Nebenwirkungen für den Organismus steigern.

Im zweiten Projekt wurde das hydrophobe Segment durch kürzlich publizierte Poly(esteramide), so genannte N-acylierte 1,4-Oxazepan-7-one (OxP), ersetzt. Dies soll die Herstellung von Polymeren mit einer maßgeschneiderten Anzahl aromatischer Einheiten in der Seitenkette ermöglichen. Mit dieser Modifikation sollte untersucht werden, ob die Stabilität der Systeme aus Projekt 1 weiter erhöht werden kann, um ihr therapeutisches Potenzial zu steigern. Zu diesem Zweck wurde die intrinsische Eigenschaft von dendritischem Polyglycerolsulfat sich in Krebsgewebe anzureichern, mit der π-Elektronenstabilisierung kombiniert, wobei Letzteres bereits sein Potenzial bei klinisch getesteten Wirkstoffträgern unter Beweis stellen konnte. Um den Einfluss von π-Elektronen-reichen Domänen auf die Stabilität zu verstehen, wurde eine Bibliothek von drei verschiedenen amphiphilen Blockcopolymeren mit unterschiedlicher π-Elektronendichte entwickelt, darunter waren (i) ohne π-Elektronen (dPGS-SS-PCL-Et); (ii) mit π-Elektronen am Kettenende (dPGS-SS-PCL-Py); und (iii) mit π-Elektronen, die entlang des hydrophoben Polymerblocks verteilt sind (dPGS-SS-POxPPh-Py). Auch hier wurden die Morphologie, die Größe und die Oberflächenladung systematisch mit Kryo-EM und Lichtstreuungstechniken analysiert. Die sphärischen Partikel zeigten monodisperse Größenverteilungen im Bereich von 81-129 nm mit starken negativen Ladungen zwischen -44 und -34 mV. Quantitative Lichtstreuungsexperimente zeigten niedrige kritische Micellenkonzentrationen (engl. CMC) von bis zu 0,3-2,1 mg/L (18-133 nM), was 55-mal niedriger ist als die CMC von herkömmlichen Blockcopolymermicellen. Zusätzliche Untersuchungen mittels UV-VIS, Fluoreszenz und Festkörper 13C-Kreuzpolarisations-NMR bewiesen das Vorhandensein von π-π-Wechselwirkungen zwischen den Polymerketten und des Wirkstoffes im aromatischen Micellenkern. Diese nicht-kovalenten Wechselwirkungen tragen einen erheblichen Anteil zu der hohen Stabilität dieses Systems bei. Außerdem wurde festgestellt, dass die Mizellen unter physiologischen Bedingungen stabil sind und dass nach vier Tagen kein Blutserumproteine auf ihrer Oberfläche absorbiert wurden. Der gezielte in vitro Abbau der Micellen durch reduktive und enzymatische Spaltung wird mit Hilfe von Lichtstreuungs- und Gelpermeationschromatographie-Experimenten (engl. GPC) analysiert. Die hohe Wirksamkeit der DTX-Formulierungen zur Hemmung des Krebszellwachstums bei verschiedenen Tumorzelllinien deutet ebenfalls auf die selektive Freisetzung des Wirkstoffs im Krebsgewebe hin, wobei die halbmaximale Hemmkonzentration (engl. IC50) effizient auf 68 nM reduziert wurde. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (engl. CLSM) wurde die erfolgreiche Einlagerung der Micellen in die Krebszellen durch Fluorescein-markiertes FITC-dPGS-SS-POxPPh-Py untersucht. Zusammenfassend ermöglicht diese Studie tiefere Einblicke in die Konzeption von Wirkstofftransportsystemen, angefangen bei ihrer Synthese, der systematischen Untersuchung ihrer Stabilität und das Verständnis ihrer molekularen Selbstorganisation bis hin zu in vitro Studien hinsichtlich ihrer Zellaufnahme, Zellverträglichkeit und Hemmung des Krebswachstums. Außerdem wird gezeigt, dass die Implementierung von π-Elektronen-reichen Domänen in selbstorganisierten dPGS-SS-Polymermicellen großes Potenzial für die Verabreichung von Arzneimitteln hat.

Diese Arbeit hat das Potenzial von dPGS-SS-Micellen als Alternative zu PEG-haltigen Wirkstoffträgersystemen für die Verabreichung von Medikamenten zu dienen hervorgehoben. Die Sulfatierung des amphiphilen Blockcopolymer-Gerüsts hatte einen entscheidenden Einfluss auf die Verteilung der Systeme im Körper und führte zu einer selektiven Anreicherung der dPGS-SS-Micellensysteme im Krebsgewebe, ohne eine Anreicherung im gesunden Gewebe zu verursachen. Darüber hinaus wurde bei der dPGS-SS-Micellen gestützten Behandlung, die zur Hemmung des Tumorwachstums erforderliche Medikamentendosis im Vergleich zur Verabreichung des freien Medikaments um das 10-fache reduziert, wodurch unerwünschte Nebenwirkungen bei den Patienten minimiert werden können. Durch den Einsatz von π-π-Wechselwirkungen im micellaren Kern konnte eine Stabilität im Hinblick auf die CMC von bis zu 0,3 mg/ml erreicht werden, was 55-mal niedriger ist als die CMC von herkömmlichen micellaren Systemen.

Für künftige Untersuchungen ist es von entscheidender Bedeutung, den zugrundeliegenden Mechanismus von dPGS-funktionalisierten Systemen zu verstehen, welcher die gezielte Anreichung der Systeme im Krebsgewebe bewirkt. Für vergleichbare Systeme wurden bereits mehrere Techniken wie die isotherme Titrationskalorimetrie (engl. ITC) oder die mikroskalige Thermophorese (engl. MST) entwickelt, mit denen sich intermolekulare Wechselwirkungen eines Polymers mit einem anderen (Bio-)Makromolekül von Interesse untersuchen lassen. Auch die Immunogenität und Antigenität von dPGS-Systemen muss noch weiter im Detail untersucht werden. Bei PEG sind Anti-PEG-IgG- und IgM-Antikörper die wichtigsten Antagonisten für die Immunantwort. Nach der weltweiten Impfkampagne zur Bekämpfung der COVID-19-Pandemie wird dieses Problem sicherlich noch stärker in den Vordergrund treten. Zur Beantwortung dieser Frage sollten Experimente mit Enzymimmunoassays (engl. ELISA) oder Oberflächenplasmonenresonanz (engl. SPR) durchgeführt werden, um mögliche Wechselwirkungen dieser Antikörper mit dem Polymer zu untersuchen. Alle diese Experimente müssen in Hinsicht auf die physiologischen Bedingungen im Blutkreislauf und in der Umgebung des Krebsgewebes durchgeführt werden. Bei der Gestaltung des Polymers sollte die chemische Vernetzung des Kerns und die Einbettung des Arzneimittels in dieses Netzwerk in Betracht gezogen werden, da diese Systeme den ungewünschten Wirkstoffverlust oder das Auseinanderfallen in der Blutbahn vollständig verhindern können. Ein weiterer kritischer Aspekt ist die Verfügbarkeit und Bereitstellung dieser Medikamentenverabreichungssysteme. Auch hier hat die COVID-19-Pandemie einen weiteren Engpass offenbart: die Herausforderungen der Kühlkettenversorgung. Daher muss ein Gefriertrocknungsverfahren für diese Medikamente entwickelt und untersucht werden, damit eine konstante und kostengünstige Versorgung gewährleistet werden kann. Das Wissen von bereits zugelassene gefriergetrockneten Nanoformulierungen kann höchstwahrscheinlich für dPGS-SS-Micellen genutzt werden; die Kernvernetzung hat sich auch beim Gefriertrocknungsprozess als vorteilhaft erwiesen.