Characterization of a novel condZfyve26–Null mouse model: A prerequisite for defining the therapeutic potential of somatic gene repair in Hereditary Spastic Paraplegia Type SPG15

Abstract

Hereditary Spastic Paraplegia (HSP) is caused by a length-dependent axonopathy of the corticospinal motor neurons, which results in progressive weakness and spasticity of the legs. There are more than 80 identified HSP gene loci and over 60 HSP gene products. Bi-allelic mutations in the Zfyve26 gene are associated with HSP type SPG15 and result in the functional loss of spastizin protein, causing defects in cellular homeostasis followed by neurodegeneration. Currently, there is no causative therapy for HSP available. This study aimed at the functional characterization and validation of a novel condZfyve26-Null mouse model as a prerequisite for testing and defining the therapeutic potential of somatic gene repair in HSP. Zfyve26 gene function was inactivated in mice using a floxed stop-cassette, resulting in animals resembling a classical knockout. General characterization: Genome modification of condZfyve26 -Null mice did not have any off-target effects on animal viability and fertility. Higher body weight of a female homozygous condZfyve26 -Null cohort compared to wild-type (WT) could hint at a hitherto undescribed sexual dimorphism in HSP. Molecular characterization: Genotyping and sequencing analyses confirmed the correct insertion of the stop-cassette into intron 2 of the murine Zfyve26 gene. Zfyve26 mRNA levels were reduced by up to >90% in brain lysates of homozygous condZfyve26 -Null animals suggesting a sufficient inactivation of Zfyve26 gene function. Characterization of motor function: Overall trend towards a worse performance in gait tests were observed in homozygous condZfyve26 -Null mice compared to WT littermates. Histological characterization: In homozygous condZfyve26 -Null mice, number of cortical neurons were reduced to 36% of WT level. Loss of Purkinje cells in the cerebellum of homozygous condZfyve26 -Null mice by 24% compared to WT were observed upon Zfyve26 disruption. Cell biological characterization: Depletion of free lysosomes and increased autophagosome levels in homozygous condZfyve26 -Null mouse adult fibroblasts hinted at defects in autophagic lysosome reformation, a pathway crucial to maintain cell homeostasis. The data support previous findings and confirm defects in the autophagic as well as lysosomal system as the underlying pathomechanism of Zfyve26 associated HSP type SPG15. Taken together the novel condZfyve26 -Null mouse line can be used as a sophisticated tool to control Zfyve26 gene expression temporally and spatially, thereby providing a valid experimental approach for testing the therapeutic potential of somatic gene repair in HSP.

Hereditäre Spastische Paraplegie (HSP) wird durch eine längenabhängige Axonopathie der kortikospinalen Motoneuronen verursacht, die zu einer fortschreitenden Schwäche und Spastik der Beine führt. Es gibt mehr als 80 identifizierte HSP-Genloci und über 60 HSP-Genprodukte. Bi-allelische Mutationen im Zfyve26 -Gen sind mit dem HSP-Typ SPG15 assoziiert und führen zu einem Funktionsverlust des Spastizin-Proteins, was Defekte in der zellulären Homöostase und Neurodegeneration verursacht. Derzeit gibt es keine ursächliche Therapie für HSP. Ziel dieser Studie war die funktionelle Charakterisierung und Validierung eines neuartigen condZfyve26 -Null-Mausmodells als Voraussetzung für die Prüfung und Definition des therapeutischen Potenzials der somatischen Genreparatur bei HSP. Die Zfyve26 Genfunktion wurde in Mäusen mittels einer gefloxten Stopp-Kassette inaktiviert. Dies sollte zur Generierung von Mäusen führen, die einem klassischen Knockout ähnelten. Allgemeine Charakterisierung: Die Genomveränderung der condZfyve26 -Null-Mäuse hatte keine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit und Fruchtbarkeit der Tiere. Das höhere Körpergewicht einer weiblichen homozygoten condZfyve26 -Null-Kohorte im Vergleich zum Wildtyp (WT) könnte auf einen bisher unbeschriebenen Geschlechtsdimorphismus bei HSP hindeuten. Molekulare Charakterisierung: Genotypisierungs- und Sequenzierungsanalysen bestätigten die korrekte Einfügung der Stopp-Kassette in Intron 2 des murinen Zfyve26 -Gens. Zfyve26 mRNA-Level waren in Hirnlysaten von homozygoten condZfyve26 -Null-Tieren um bis zu >90% reduziert, was auf eine ausreichende Inaktivierung der Zfyve26 -Genfunktion schließen ließ. Charakterisierung der motorischen Funktion: Bei homozygoten condZfyve26 -Null-Mäusen wurde im Vergleich zum WT ein allgemeiner Trend zu einer schlechteren Leistung in Bewegungstests beobachtet. Histologische Charakterisierung: Bei homozygoten condZfyve26 -Null- Mäusen war die Anzahl der kortikalen Neuronen auf 36% des WT-Niveaus reduziert und ein Verlust von 24% der Purkinje-Zellen im Kleinhirn wurde nach der Zfyve26 -Disruption beobachtet. Zellbiologische Charakterisierung: Die Abnahme freier Lysosomen und der erhöhte Autophagosomenspiegel in homozygoten condZfyve26 -Null-Mausfibroblasten deuteten auf Defekte bei der autophagischen Lysosomenreformation hin, ein für die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase entscheidender Mechanismus. Die Daten unterstützen frühere Befunde und bestätigen Defekte im autophagischen und lysosomalen System als zugrundeliegenden Pathomechanismus der Zfyve26 -assoziierten HSP Typ SPG15. Zusammenfassend kann die neuartige condZfyve26 -Null-Mauslinie als hochentwickeltes Werkzeug zur zeitlichen und räumlichen Kontrolle der Zfyve26 -Genexpression verwendet werden und bietet damit einen validen experimentellen Ansatz zur Prüfung des therapeutischen Potenzials der somatischen Genreparatur bei HSP.