Charakterisierung der Replikationsfaktoren des porcinen Circovirus in Bezug auf Initiation und Termination der viralen Replikation

Abstract

Unter DNA-Replikons, welche über rolling circle Replikation (RCR) replizieren, stellen die Bindung an den doppelsträngigen Replikationsorigin (dso) und die Einführung eines strang- und sequenzspezifischen Einzelstrangbruchs essentielle Stufen für den Ablauf der Replikation dar. Während die aus dem Einzelstrangbruch resultierende 3 -Hydroxygruppe als Primer für die nachfolgende DNA-Synthese fungiert, wird die 5 -Phosphatgruppe durch den neu synthetisierten DNA-Strang verdrängt. Nach einer Syntheserunde und zweiter Restriktion innerhalb des regenerierten Replikationsorigins werden die Enden des neu synthetisierten DNA-Moleküls zum zirkulär geschlossenen Genom verknüpft. Aufgrund konservierter Motive sowohl innerhalb der Aminosäuresequenz der Replikationsproteine als auch der Nukleotidsequenz des viralen Replikationsorigins wird die Replikation auch der porcinen Circoviren Typ 1 und Typ 2 (PCV1 und PCV2) über RCR postuliert. In dieser Arbeit wurde erstmals die Restriktions-und Ligationsaktivität der PCV-Replikationsproteine Rep und Rep gegenüber dem viralen Replikationsorigin in vitro demonstriert. Beide Enzyme schneiden den viralen Plusstrang zwischen den Nukleotiden sieben und acht innerhalb des konservierten Nonamers 5 -T1AGTATTAC9-3 und werden nachfolgend kovalent mit dem 3 -Schnittprodukt verknüpft. Für die Einführung des Einzelstrangbruchs wurde das Nonamer als essentielle Sequenzanforderung identifiziert, wohingegen die Ausbildung einer Haarnadelstruktur keine Voraussetzung für die Restriktion in vitro darstellt. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass Rep und Rep einzelsträngige Originfragmente in vitro ligieren, was eine Funktion von PCV-Rep/Rep hinsichtlich der Termination der viralen Replikation wahrscheinlich erscheinen lässt. Die Ligation ist abhängig von vorangegangener Restriktion und räumlicher Nähe der Substrate. Letzteres wird über Basenpaarung über den Bereich der inversen Repetition gewährleistet. Mit Hilfe von Mutanten der Rep-Proteine wurde die Abhängigkeit der Restriktion von der Integrität der Aminosäuremotive I, II und III verdeutlicht und Tyrosin-93 als das katalytische Zentrum der Reaktion identifiziert. Die GKS- Box wurde erstmals als Voraussetzung für die ATP-Hydrolyse des Rep-Proteins nachgewiesen, diese konservierte Sequenz hat aber keinen Einfluss auf die Restriktion des Replikationsorigins durch Rep und Rep . Durch den Nachweis homologer sowie heterologer Ineraktion der Replikationsproteine Rep und Rep steht zu vermuten, dass die Termination der Replikation durch Tyrosin-93 als Bestandteil eines Rep/Rep -Dimers oder Oligomers höherer Ordnung und nicht durch eine zweite aktive Aminosäure auf dem selben Monomer katalysiert wird. Über einen Replikationsassay wurde die Bedeutung der konservierten Motive innerhalb der Replikationsproteine für die virale Replikation in PK15-Zellen demonstriert. Weiterhin wurde die Rekrutierung von PCV-Rep/Rep an den dso über Interaktion mit den Hexameren H1 und H2 bestätigt. Die Ausbildung einer Haarnadelstruktur als Voraussetzung für die Initiation innerhalb des einzelsträngigen Bogenbereichs sowie eine Abhängigkeit der Termination von der Sequenzspezifität upstream des Nonamers wird vermutet.

DNA cleavage and ligation are pivotal steps for initiation and termination of genome replication via the rolling circle mechanism. After recruitment of the replicon-encoded initiator protein, replication is initiated by introduction of a strand- and site-specific nick within the double-stranded origin of replication (dso). The resulting free 3 -hydroxyl group serves as a primer for DNA synthesis, while the 5 -phosphate group is displaced during DNA replication. After at least one round of replication, the nascent strand is cleaved again within the regenerated origin and the 5 -phosphate end is ligated to the newly created 3 -hydroxyl group resulting in release of unit- length monomers. Due to characteristic sequences found within the origin of replication and the replication proteins, genome amplification of porcine circoviruses type 1 and type 2 (PCV1 and PCV2) is assumed to be mediated by rolling circle replication. This study demonstrated for the first time the ability of Rep and Rep of PCV to introduce and reseal strand discontinuities within the origin of replication in vitro. Rep and Rep cleave the viral strand between nucleotides 7 and 8 within the conserved nonamer 5 -T1AGTATTAC9-3 and become covalently attached to the 3 -cleavage product. The conserved nonamer is the only sequence element identified necessary for cleavage. Since PCV Rep and Rep are also capable of resealing the viral single-stranded DNA, participation of these proteins in termination of replication is suggested. In this context, joining was strictly dependent on preceding substrate cleavage as well as close proximity of origin fragments presumably accomplished by base pairing. Cleavage of origin fragments in vitro depends on conserved motives I, II and III. Mutation analysis identified tyrosine-93 as the catalytic amino acid. In contrast, the GKS box is not essential for DNA cleavage, although PCV Rep was proven to hydrolyse ATP in vitro. Formation of homo- and heterocomplexes of the replication proteins was observed. This supports the hypothesis that Rep/Rep form a dimer or multimer for initiating and terminating RCR, thereby providing the second catalytic center essential for termination. The impact of the motives conserved in the replication proteins as well as in the origin of replication was tested in a cell culture-based replication asay. Integrity of conserved motives I, II, III as well as the GKS box and the ability of of PCV Rep/Rep to promote replication are linked. Recruitment of Rep and Rep to the viral origin by binding to hexamers H1/H2 of the minimal binding site was demonstrated to be a prerequisite for replication. Cruciform extrusion for providing the single- stranded DNA conformation of the nonamer indispensable for cleavage and dependency of termination on sequences flanking the nonamer is suggested.