Next Generation Mesenchymal Stromal Cells for Regenerative Purposes - Manipulation of the Cellular Phenotype Using Biomaterials and Non-viral Gene Transfer

Abstract

The sum of different microenvironment stimuli precisely regulates cell phenotype and behavior. Synergistic strategies, which make use of this multimodality could be harnessed to precisely control functions of therapeutic cells. In this thesis I have established and applied a combination of biomaterial encapsulation and mRNA transfection to shape the paracrine profile of mesenchymal stromal cells (MSCs), a secretory active cell type shown to be safe but not always efficacious in clinical trials. To stimulate growth factor secretion through cell-material interactions, MSCs were encapsulated in collagen and HA (Col-HA) hydrogel, or control hydrogels made from HA, PEG, and gelatin. MSC showed stronger elongation and an expanded growth factor profile in Col-HA with distinct upregulation kinetics for HGF versus VEGF. MSCs were transfected with in vitro transcribed mRNA coding for GFP and VEGF using lipofectamine. Uridine was substituted by different chemically modified derivates, including 5-methoxy-uridine (5moU). Unmodified mRNA triggered a type-I interferon response in MSCs and upregulated pro-inflammatory cytokine secretion, while downregulating pro-angiogenic growth factors. 5moU-mRNA did not trigger a detectable type-I interferon response and allowed for prolonged gene overexpression without disturbing the MSC's natural secretome. Finally, a protocol for sequential mRNA transfection and hydrogel encapsulation was developed. The effects of mRNA transfection on cell-material interactions were evaluated. Only 5moU-mRNA, but not unmodified mRNA, allowed for sequential transfection and encapsulation with high cell viability and preserved hydrogel-dependent effects on growth factor secretion. Conversely, the effect of cell-matrix adhesion on mRNA transfection was investigated by comparing GFP expression and VEGF secretion in Col-HA, which contains integrin ligand motifs, versus a PEG-HA control gel, which does not. In Col-HA, MSCs secreted higher levels of mRNA-encoded VEGF than in PEG-HA, but no difference in GFP fluorescence was observed, suggesting that secretion, but not translation of mRNA-encoded protein is adhesion-sensitive. The results show that broad secretome stimulation by cell-material interactions can be orthogonally combined with high mRNA overexpression of a selected key factor, to shape the MSC secretome on multiple levels. Additionally, we identified a synergy be-tween secretion of targeted mRNA-encoded factors and cell adhesion. Importantly, 5moU-mRNA can be used to express a gene of interest while leaving the remaining cellular phenotype largely unaffected. Open questions include elucidating mechanistic connections between cell-material interactions and the temporal changes in secretion profile, as well as showing a therapeutic utility of such a multimodal system. The concept proposed here could be expanded into generalized stimulome models of synergies and antagonisms between different cell-instructive stimuli.

Die Summe verschiedener Reize aus dem Mikromilieu reguliert den Phänotyp und das Verhalten von Zellen. Synergistische Strategien, welche diese Multimodalität berücksich tigen, könnten genutzt werden, um die Funktion therapeutischer Zellen präzise zu kon trollieren. In dieser Arbeit habe ich eine Kombination aus Biomaterialeinbettung und mRNA Transfektion etabliert, um das parakrine Profil Mesenchymaler Stromazellen (MSCs) zu formen. MSCs sind ein sekretorisch aktiver Zelltyp, welcher sich in klinischen Studien als sicher, aber nicht immer wirkungsvoll erwiesen hat. Um Wachstumsfaktorsekretion mittels Zell-Material-Interaktionen zu stimulieren, wurden MSCs in Kollagen-HA (Col-HA) Hydrogel eingebettet. Als Kontrolle dienten HA-, PEG und Gelatinegele. MSCs in Col-HA wiesen stärkere Elongation und ein expandiertes Sek retionsprofil mit unterschiedlichen Kinetiken für HGF und VEGF auf. MSCs wurden mittels Lipofektamin mit in vitro transkribierter mRNA transfiziert, welche GFP bzw. VEGF kodiert. Uridin wurde durch Varianten wie 5-Methoxy-Uridin (5moU) er setzt. Unmodifizierte mRNA löste eine Typ-I Interferonantwort aus, erhöhte die Ausschüt tung proinflammatorischer Zytokine und senkte proangiogene Faktoren. 5moU-mRNA löste keine detektierbare Interferonantwort aus und erlaubte eine verlängerte Genexpres sion, ohne Beeinträchtigung des natürlichen Sekretionsprofils. Zuletzt wurde die mRNA Transfektion sequentiell mit der Hydrogeleinbettung kombiniert. Nur 5moU-mRNA, nicht jedoch unmodifizierte mRNA erlaubte die sequentielle Kombina tion beider Methoden bei hoher Zellviabilität und erhaltenen Hydrogeleffekten auf die Fak torfreisetzung. Umgekehrt wurde auch der Einfluss der Matrixadhäsion auf die mRNA Transfektion untersucht. GFP Expression und VEGF Sekretion wurden in Col-HA versus PEG-HA, welches keine Integrinliganden enthält, verglichen. In Col-HA sezernierten die MSCs mehr mRNA-kodiertes VEGF als in PEG-HA. Das GFP Signal war vergleichbar, was nahelegt, dass nicht die Translation, sondern die Sekretion adhäsionssensitiv ist. Die Ergebnisse zeigen, dass die breite Sekretomstimulation durch Zell-Material-Interak tionen orthogonal mit mRNA Überexpression eines ausgewählten Schlüsselmediators kombiniert werden kann, um das MSC Sekretom auf meheren Ebenen zu formen. 5moU-mRNA kann zur Expression eines gewünschten Gens verwendet werden, ohne den übrigen Zellphänotyp zu beeinträchtigen. Zudem konnten wir einen Synergismus zwischen Zelladhäsion und der Freisetzung mRNA-kodierter Faktoren identifizieren. Offen bleibt die Frage nach den genauen Mechanismen, durch welche die Zell-Material-Interaktionen zu zeitlichen Veränderungen im Sekretionsprofil führen. Außerdem muss der therapeutische Nutzen eines solchen multimodalen Systems gezeigt werden. Das hier vorgeschlagene Konzept könnte zu allgemeineren Stimulom-Modellen synergistischer bzw. antagonistischer Reizinteraktionen erweitert werden.