Molekularbiologische und funktionelle Charakterisierung von ALCAM und SFRP1 als mögliche Schlüsselgene der gestörten Hämatopoese beim Myelodysplastischen Syndrom

Abstract

Das Myelodysplastische Syndrom (MDS) ist eine klonale Knochenmarkerkrankung, die aus genetischen und epigenetischen Ereignissen in den hämatopoetischen Stammzellen resultiert und eine gestörte Hämatopoese nach sich zieht. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung von ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) und SFRP1 (Secreted frizzled related protein 1) als potentielle Schlüsselgene der gestörten Hämatopoese beim MDS. Im ersten Teil der Arbeit wurde mittels RNA-Mikroarray- und real time RT-PCR-basierten Genexpressionsanalysen erstmals eine erhöhte transkriptionelle Expression des Zelladhäsionmoleküls ALCAM in mononukleären Zellen des Knochenmarks, in selektierten CD71+, erythroiden Vorläuferzellen sowie in CD34+, hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen aus MDS-Patienten detektiert. Durch vektorbasierte ALCAM-Überexpression in leukämischen Zelllinien sollte ein in-vitro Modellzellsystem etabliert werden, das die Rolle von ALCAM hinsichtlich seiner Bedeutung für die Proliferation, Apoptose und Differenzierung funktionell charakterisiert. Die anhand der stabil modifizierten Erythroleukämie-Zelllinie HEL durchgeführten Funktionsstudien wiesen ein vermindertes Zellwachstum, eine deutliche Zunahme der Apoptoserate sowie ein aberrantes erythoides Differenzierungsverhalten unter ALCAM- Überexpression nach. Diese Beobachtungen sowie die erhöhte transkriptionelle ALCAM-Expression in CD71+, erythroiden Vorläuferzellen der MDS-Patienten implizierten, dass ALCAM an der für das MDS charakteristischen dysregulierten Erythropoese beteiligt sein könnte. Im zweiten Teil der Arbeit detektierten RNA Mikroarray- und real time RT-PCR-basierte Genexpressionsanalysen eine signifikante transkriptionelle Herunterregulation des WNT-Antagonisten SFRP1 erstmals in mononukleären Zellen des Knochenmarks und in selektierten CD34+, hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen aus MDS-Patienten sowie im Knochenmark aus Patienten mit akuten Leukämien. Da in publizierten Studien eine Assoziation der transkriptionelle Herunterregulation von SFRP1 mit einer DNA-Hypermethylierung des Promotors in verschiedenen Malignitäten gezeigt werden konnte, wurde der SFRP1-Promotormethylierungsstatus erstmals in MDS- Patienten untersucht. Unter Anwendung der Pyrosequenzierungstechnik wurde zwar eine Zunahme der mittleren Promotormethylierung festgestellt, eine frequente Hypermethylierung des SFRP1-Promotors ähnlich wie in akuten Leukämien wurde jedoch nicht beobachet. Zudem wurden keine inaktivierenden Mutationen innerhalb des SFRP1-Promotors detektiert. Des Weiteren wurde eine Assoziation der verminderten SFRP1-Expression mit einer transkriptionellen Hochregulation der WNT-Rezeptorisoform FZD3 sowie weiterer WNT-Signalweg-Gene beobachtet, was eine potentielle Beteiligung des aberrant aktivierten WNT-Signalweges an der Pathogenese des MDS vermuten läßt. Demnach ist der Verlust oder eine Verminderung des WNT-Antagonist SFRP1 vermutlich an der Entstehung der ineffektiven Hämatopoese des MDS beteiligt. SFRP1 und ALCAM wurden als differentiell exprimierte Schlüsselgene beim MDS identifiziert und ihre potentielle Beteiligung an der Pathogenese des MDS teilweise erläutert. Zudem bestätigt die differentielle Genexpression von ALCAM und SFRP1 in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen die Theorie, dass die ineffektive Hämatopoese beim MDS aus pathogenetischen Ereignissen in den hämatopoetischen Stammzellen resultiert.

Myelodysplastic syndromes (MDS) are clonal disorders of hematopoietic stem cells resulting in bone marrow failure and ineffective hematopoiesis. Chromosomal abnormalities, genetic alterations and epigenetic deregulations of certain genes are possible causes of multiple dysregulated hematopoiesis in MDS. The aim of the present thesis was to identify and characterize genes associated with the pathogenesis of MDS such as ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) and SFRP1 (Secreted frizzled related protein 1). In the first part of the present work, RNA oligonucleotide microarray and real time RT-PCR-based gene expression analyses revealed an increased transcriptional expression of the cell adhesion molecule ALCAM in mononuclear bone marrow cells, in CD71+, erythroid progenitor cells and in CD34+, hematopoietic stem and progenitor cells of patients with MDS. Several human leukemic cell lines were used to establish an ALCAM over-expression in-vitro model to characterize the functional role of ALCAM in proliferation, apoptosis and differentiation in dysregulated hematopoiesis in MDS. The data revealed that in-vitro, ALCAM overexpressing erythroleukemic cell line HEL had reduced proliferation, an increased apoptosis rate and an aberrant erythroid differentiation mirroring clinical characteristics of MDS. These findings and the increased transcriptional up-regulation of ALCAM in CD71+, erythroid MDS progenitor cells suggested a potential role of ALCAM in insufficient erythropoiesis. In the second part, RNA oligonucleotide microarray and real time RT-PCR gene expression analyses for the WNT pathway antagonist SFRP1 were performed. Significant transcriptional down-regulation of SFRP1 was detected in mononuclear bone marrow cells and in CD34+, hematopoietic stem and progenitor cells from patients with MDS as well as in bone marrow of patients with acute leukemia. Recently published studies in several solid and hematological malignancies revealed an association between transcriptional SFRP1 down-regulation and DNA hypermethylation of the SFRP1 promoter suggesting a potential role for deregulated WNT signalling in pathogenesis of these cancer diseases. Therefore, the SFRP1 promotor methylation status was studied in hematopoietic cells of MDS patients using pyrosequencing technique. Indeed, analyses showed an increase of the mean CpG methylation in the examined promotor regions, but a frequent promotor hypermethylation similar to acute leukemia was not detected. Moreover, inactivating mutations of the SFRP1 promoter in the MDS patients were not observed. Furthermore, an association between the transcriptional down-regulation of SFRP1 with up-regulation of the Wnt receptor FZD3 and of further WNT pathway-related genes was observed in MDS patients. These findings indicated a potential role for the Wnt inhibitor SFRP1 and aberrant activation of the WNT signalling pathway in pathogenesis of MDS. SFRP1 and ALCAM have been identified as differentially expressed target genes in dyshematopoiesis of MDS. In this study, the functional roles of SFRP1 and ALCAM in the pathomechanism of MDS were partially elucidated. The observations suggested an important role in dyshematopoiesis. In addition, the results of the presented experiments indicated that hematopoietic stem cells of MDS patients showed gene expression alterations supporting the theory that MDS is caused by a variety of genetic deregulations early in the development of hematopoietic stem cells.