Untersuchungen zur pathophysiologischen Bedeutung muskarinerger Acetylcholinrezeptoren in Dystonie-Modellen

Abstract

Dystonien sind schwer therapierbare Bewegungsstörungen, deren Pathophysiologie nahezu ungeklärt ist. Anticholinergika mit Wirkung am muskarinergen Acetylcholinrezeptor vom Subtyp 1 (mAChR1) bewirken zwar bei einigen Dystoniepatienten eine Besserung, rufen jedoch eine Vielzahl schwerwiegender Nebenwirkungen hervor. Für die Entwicklung von Anticholinergika mit einem günstigeren Wirkungsprofil könnte der mAChR4 eine interessante Zielstruktur sein. Ziel dieses Promotionsvorhabens war es daher die pathophysiologische Bedeutung des cholinergen Neurotransmittersystems in zwei anerkannten Dystoniemodellen mittels verschiedener Methoden zu untersuchen, um damit einen Beitrag zur Verbesserung der Therapie von Dystonien zu leisten. Der dtsz- Hamster ist ein Tiermodell für die primäre paroxysmale Dystonie. In vorgegangenen Untersuchungen führte die akute systemische Applikation des mAChR1-Antagonisten Trihexyphenidyl (THP) oder des relativ selektiven mAChR4-Antagonisten Tropicamid nur zu moderaten antidystonen Effekten beim dtsz-Hamster (Löscher und Fredow, 1992; Smiljanic, 2010). Daher sollte untersucht werden, ob stärkere Effekte erzielt werden können durch (1) die akute kombinierte Verabreichung von THP plus Tropicamid, (2) eine Verlängerung des Behandlungszeitraums oder (3) die lokale Manipulation striataler mAChR1 und mAChR4. Die Applikation des nur peripher wirksamen mAChR1-Antagonisten Pirenzepin sollte zudem zeigen, inwiefern die bekannte antidystone Wirkung von mAChR1-Antagonisten über periphere Effekte vermittelt wird. Mittels Rezeptorautoradiographie wurde untersucht, ob regionale Veränderungen einzelner mAChR-Subtypen im Gehirn dystoner Hamster bestehen. Die akute kombinierte Verabreichung von THP und Tropicamid führte in der vorliegenden Studie erwartungsgemäß zu einer stärkeren Effektivität als die alleinige Applikation der beiden Substanzen. Dies konnte allerdings nicht durch eine chronische Gabe potenziert werden. Die wesentlich schwächeren Effekte nach striataler Applikation der beiden Substanzen sowie des allosterischen Modulators VU0152100 am mAChR4 lassen eine Beteiligung extrastriataler Gehirnregionen vermuten. Fehlende Effekte von Pirenzepin sprechen gegen eine Beteiligung peripherer mAChR1 an der antidystonen Wirksamkeit von klinisch eingesetzten mAChR1-Antagonisten. Insgesamt stützen die hier vorliegenden Resultate die Hypothese einer kritischen Beteiligung der (striatalen) cholinergen Neurotransmission am Dystoniegeschehen im dtsz-Hamster nicht, was zudem durch die nahezu unveränderte Dichte von mAChR1, 2 und 4 in verschiedenen Gehirnregionen unterstrichen wird. Allerdings kann nicht ausgeschlossen werden, dass bislang nicht verfügbare Substanzen mit einer höheren Selektivität gegenüber verschiedenen mAChRSubtypen stärkere Effekte hervorgerufen hätten. Verschiedene transgene Mauslinien, die das humane Defektgen (DYT1) der Early-onset- Torsionsdystonie tragen, zeigen keine Dystonie-Symptomatik (Sharma et al., 2005; Shashidharan et al., 2005; Grundmann et al., 2007). Diese Mäuse können zum Verständnis beitragen, warum nur ca. 30-40% der humanen DYT1-Genträger Dystonien entwickeln und welche Faktoren zur Manifestation führen. Vorangehende in-vitro Untersuchungen der in dieser Arbeit verwendeten DYT1-Mäuse lassen vermuten, dass die DYT1-Mutation eine Überaktivität des cholinergen Systems bewirkt (Martella et al., 2009; Pisani et al., 2006). Mit Hilfe der hier durchgeführten pharmakologischen in- vivo Untersuchungen sollte der funktionellen Relevanz der vorherigen in-vitro Befunde nachgegangen werden, wobei besonderes Augenmerk auf die mögliche Provokation dystoner Symptome gelegt wurde. Weiterhin sollte durch immunhistochemische Untersuchungen geklärt werden, ob der zuvor ermittelten cholinergen Überaktivität eine erhöhte Dichte striataler cholinerger Interneurone zugrunde liegt. Westernblot-Analysen sollten zudem klären, ob eine durch die DYT1- Mutation verursachte erhöhte Expression des für die ACh- Synthese wichtigen Enzyms Cholinacetyltransferase (ChAT) vorliegt. Durch die akute und chronische Applikation des Cholinomimetikums Pilocarpin konnte keine Dystonie bei DYT1-Mäusen provoziert werden. Allerdings zeigten DYT1-Mäuse nach chronischer Gabe ein tendenziell stärkeres Auftreten von Nebenwirkungen, was auf eine Störung des cholinergen Systems bei diesen Tieren hindeuten könnte. Durch die leicht erhöhte Inzidenz von epileptischen Anfällen nach wiederholter intrastriataler Applikation von Pilocarpin könnte über eine veränderte synaptische Plastizität bei DYT1-Mäusen spekuliert werden. Insgesamt unterstützen diese Befunde, eine nahezu unveränderte Dichte striataler cholinerger Interneurone sowie eine zu Wildtyp-Mäusen vergleichbare Expression der ChAT in verschiedenen Gehirnregionen nicht die Hypothese einer funktionellen Relevanz der zuvor mittels in-vitro Untersuchungen ermittelten striatalen cholinergen Überaktivität in DYT1- Mäusen. Durch die Verwendung des unspezifischen Cholinomimetikums Pilocarpin und eine Beschränkung auf systemische und intrastriatale pharmakologische Manipulationen kann bislang jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass nur bestimmte mAChR-Subtypen bzw. extrastriatale Gehirnregionen pathophysiologisch involviert sind. Dieser Frage sollte durch weiterführende rezeptorautoradiographische Untersuchungen nachgegangen werden.

Dystonia is a movement disorder, which is often intractable. Its pathophysiology is poorly understood. Anticholinergic drugs which are selective for the muscarinic acetylcholine receptor subtype 1 (mAChR1) exert beneficial effects in some patients but also provoke a wide range of severe side effects. In order to develop anticholinergics with an improved efficacy and safety, the mAChR4 seems to be an interesting therapeutical target. The aim of this study was to further clarify the pathophysiological role of the cholinergic system by using different methods in two established animal models of dystonia and thus contribute to the improvement of therapeutic strategies. The dtsz hamster represents an animal model of primary paroxysmal dystonia. As indicated by previous studies, the acute systemic administration of the mAChR1-antagonist trihexyphenidyl (THP) or of the relatively selective mAChR4-antagonist tropicamide exerted only moderate antidystonic effects in dtsz hamsters (Löscher and Fredow, 1992; Smiljanic, 2010). Therefore, it should be examined whether stronger effects could be achieved by (1) the acute combined administration of THP and tropicamide, (2) long-term treatment, or (3) a local manipulation of striatal mAChR1 and mAChR4. Furthermore, the administration of the peripherally active mAChR1-antagonist pirenzepine should elucidate if the known antidystonic efficacy of mAChR1-antagonists may be mediated by peripheral effects. In addition, autoradiographic analysis was performed to clarify if there are distinct alterations of mAChR-subtypes in brain regions of dystonic hamsters. In the present investigations, the acute combined treatment with THP and tropicamide resulted in a greater efficacy than the application of the single compounds. However, this efficacy could not be potentiated by chronic treatment. Striatal microinjections of both compounds or the mAChR4-selective allosteric modulator VU0152100 exerted weaker effects, indicating that systemic effects are mediated by extrastriatal brain regions. The lack of efficacy of pirenzepine suggests that beneficial effects of clinically used mAChR1- antagonist are not based on peripheral inhibition of the cholinergic system. In summary, the present results did not show a critical involvement of the (striatal) cholinergic system in the dystonic syndrome of the dtsz hamster, as underlined by a widely unchanged density of mAChR1, 2 and 4 in different brain regions. Nevertheless, it cannot be excluded that agents with higher selectivity for mAChR-subtypes, which are not available so far, might exert more pronounced effects. Different transgenic mouse lines, which carry the human defect gene (DYT1) for the earlyonset torsion dystonia, do not exhibit dystonic symptoms (Sharma et al., 2005; Shashidharan et al., 2005; Grundmann et al., 2007). Nevertheless, these mice may contribute to understand why only 30-40% of the human DYT1 gene carriers develop dystonia and which factors lead to its manifestation. Previous in-vitro studies in DYT1 mice, which were used in this work, suggest that the DYT1 mutation results in an overactivity of the cholinergic system (Martella et al., 2009; Pisani et al., 2006). Pharmacological in-vivo experiments were carried out to investigate the functional relevance of these in-vitro findings, paying particular attention to the possible induction of a dystonic phenotype. Furthermore, it should be clarified by immunohistochemical studies, whether the previously identified cholinergic overactivity is based on an increased density of striatal cholinergic interneurons. Western blot analysis was carried out to elucidate, if the DYT1 mutation is related to an increased expression of choline acetyltransferase (ChAT), the key enzyme for the ACh synthesis. The acute and chronic administration of the cholinomimetic drug pilocarpine did not provoke dystonia-like movements in DYT1 mice. However, after chronic administration DYT1 mice showed a trend towards more pronounced side effects, which may indicate a disturbance of the cholinergic system in these animals. The slightly increased incidence of epileptic seizures after repeated local striatal administration of pilocarpine let presume an altered synaptic plasticity in DYT1 mice. Together with the findings of an almost unchanged density of striatal cholinergic interneurons as well as the unchanged expression of ChAT in different brain regions in comparison to wild-type mice, the present results do not suggest a functional relevance of a striatal cholinergic overactivity, as previously found in these mice by in-vitro experiments. However, with regard to the use of the non- specific cholinomimetic pilocarpine and to a restriction on systemic and intrastriatal pharmacological manipulations, it cannot be excluded, that only certain mAChR-subtypes or extrastriatal brain regions are pathophysiologically involved. This question should be further investigated by receptor autoradiographic studies.