Investigation of Fragment-based Inhibitors of 3C and 3CL Proteases of Enterovirus D68 and SARS-CoV-2 Targeting the S1 Site with Different Glutamine Mimetics

Abstract

During the last decades virus infections posed a serious threat to humanity and have been studied intensively. However, the inadequate knowledge was evident during the global outbreak of the SARS-CoV-2 pandemic in recent years and demonstrated the need for further research and drug development. 3C and 3CL proteases of Riboviria are validated drug targets for the treatment of virus infections with a unique substrate specificity for glutamine in the S1 site. Numerous reported and approved protease inhibitors are peptidomimetics, however, they display limitations in pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Here, I present the design and evaluation of small molecule inhibitors against two proteases of Riboviria species using fragment-based methods. Furthermore, two different glutamine mimetics are validated for binding into the S1 pocket, namely the benzamide and the pyridine providing similar interactions as the native glutamine residue. The enterovirus D68 3C protease was used as a template for the evolution of Michael acceptors through a protein-templated Knoevenagel reaction and presented the first reported protein-templated carbon-carbon coupling. Further analysis of the resynthesized Michael acceptors regarding their binding modes, stability, and kinetics with enzyme assays, isothermal titration calorimetry, biolayer interferometry, HPLC-QTOF-MS, and protein MS suggested covalent reversible inhibitors with prolonged residence time at the protein to be the most active antivirals. Further investigations of chemical and kinetic stabilities of prominently reported and newly synthesized acylating fragment inhibitors of the main protease of SARS-CoV-2 confirmed the importance of the stability of the protease-inhibitor complexes. Despite improvements in the chemical stability, synthesized pyridinyl carbonates could not inhibit the proliferation of SARS-CoV-2 in infected cells probably due to the high vulnerability against hydrolysis of the acylated enzymes. Therefore, a library of pyridine fragments with different electrophiles was synthesized and tested for their inhibitory activity, producing a more stable covalent fragment inhibitor with aldehyde function and high ligand efficiency as a promising starting point for the evolution into a drug-like molecule. Finally, protein-templated Ugi reactions were investigated with fluorescence-based enzyme assays, HPLC-QTOF-MS, and native MS using the SARS-CoV-2 main protease as template, however, without the finding of a protein-catalyzed effect on the multicomponent reaction. With the obtained knowledge, an in-situ screening for the development of noncovalent inhibitors against 3C and 3CL proteases was generated and validated with reported Ugi product inhibitors of the main protease of SARS-CoV-2. With the high significance of multicomponent reactions (MCRs) in drug synthesis and the limited knowledge about protein-templated MCRs, this work constitutes an important contribution to the understanding of these reactions. The summarized results in this thesis present new and important insights into the development of fragment-based inhibitors and can be used to obtain potent protease inhibitors.

Innerhalb der letzten Jahrzehnte wurden Virusinfektionen intensiv erforscht, da sie eine ernstzunehmende Bedrohung für die Menschheit darstellen. Der weltweite Ausbruch der SARS-CoV-2 Pandemie in den letzten Jahren zeigte jedoch die Notwendigkeit für weitere Forschung und Entwicklung an Arzneimitteln auf. Die 3C und 3CL Proteasen des Reichs Riboviria sind validierte Arzneimitteltargets für die Behandlung von Virusinfektionen und besitzen eine einzigartige Substratspezifität für Glutamin in der S1 Tasche. Zahlreiche literaturbekannte und zugelassene Inhibitoren sind Peptidomimetika, die jedoch in ihren pharmakokinetischen und -dynamischen Eigenschaften limitiert sind. In dieser Arbeit zeige ich die Entwicklung und Evaluierung von kleinen Molekülinhibitoren gegen zwei Proteasen von Riboviriaspezien mithilfe von fragmentbasierten Methoden. Zusätzlich konnten zwei Glutaminmimetika als S1-bindende Fragmente validiert werden, das Benzamid und das Pyridin, die ähnliche Interaktionen wie der native Glutaminrest ausbilden. Die Enterovirus D68 3C Protease wurde als Template für die Entwicklung von Michaelakzeptoren durch eine Proteintemplat-gesteuerte Knoevenagelreaktion genutzt und präsentiert die erste berichtete Proteintemplat-gesteuerte C-C Kupplung. Anhand weiterer Untersuchungen mit den resynthetisierten Michaelakzeptoren bezüglich ihrer Bindungsmodi, ihrer Stabilität und ihrer Kinetik mit Enzymassays, isothermer Titrationskalorimetrie, Bio-Layer-Interferometrie, HPLC-gekoppelter QTOF-Massenspektrometrie und Protein-Massenspektrometrie konnte abgeleitet werden, dass die aktivsten antiviralen Wirkstoffe kovalent reversible Inhibitoren mit verlängerter Verweilzeit am Protein sind. Bedeutende literaturbekannte und neusynthetisierte acylierende Fragmentinhibitoren gegen die SARS-CoV-2 Hauptprotease wurden weiterhin auf ihre chemische und kinetische Stabilität untersucht und bestätigten die Bedeutung der Stabilität der Protease-Inhibitor-Komplexe. Obwohl Verbesserungen in der chemischen Stabilität durch die Synthese von Pyridinylcarbonaten erreicht wurden, konnten die Verbindungen die Vermehrung von SARS-CoV-2 in infizierten Zellen wahrscheinlich durch die hohe Hydrolyseanfälligkeit der acylierten Enzyme nicht verhindern. Aus diesem Grund wurde eine Bibliothek an Pyridinfragmenten mit verschiedenen Elektrophilen synthetisiert und hinsichtlich ihrer inhibitorischen Aktivität getestet. Aus dieser Bibliothek wurde ein stabiler kovalenter Fragmentinhibitor mit Aldehydfunktion und hoher Ligandeneffizienz identifiziert, der einen vielversprechenden Startpunkt für die weitere Entwicklung zu einem Wirkstoffmolekül darstellt. Letztendlich wurden Proteintemplat-gesteuerte Ugi-Reaktionen an der SARS-CoV-2 Hauptprotease mithilfe von fluoreszenzbasierenden Enzymassays, HPLC-QTOF-MS und nativer MS untersucht, jedoch ohne den Nachweis einer proteinverstärkten Ugi-Produktbildung. Mit den gewonnenen Erkenntnissen konnte ein in-situ Screening für die Entwicklung von nichtkovalenten Inhibitoren gegen 3C und 3CL Proteasen entwickelt werden, dass anhand von literaturbekannten Ugi-Produktinhibitoren gegen die Mpro von SARS-CoV-2 validiert wurde. Durch die hohe Signifikanz der Multikomponentreaktionen in der Arzneimittelsynthese und das bisher limitierte Wissen über Proteintemplat-gesteuerte Multikomponentreaktionen stellt diese Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis dieser Reaktionen dar. Die zusammengefassten Ergebnisse in dieser Doktorarbeit präsentieren neue und wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung von fragmentbasierten Inhibitoren und können genutzt werden, um potente Proteaseinhibitoren zu generieren.