Reverse Genetik und rekombinante Viren in der Impfstoffentwicklung

Abstract

Diese Arbeit beschreibt die erfolgreiche Nutzung des reversen Genetik Systems für das Impfvirus B/HPIV3 im Hinblick auf die Einbringung eines immunmodulierenden Gens. Es wurde de novo von cDNA eine B/HPIV3 Mutante mit einer zusätzlichen IP10 Geneinheit, B/HPIV3-IP10, geschaffen. IP10 ist ein Chemokin, das bei viralen Atemwegsinfektionen eine schützende und immunstimulierende Wirkung ausübt. B/HPIV3-IP10 exprimierte erfolgreich das Protein und replizierte in vitro ebenso gut wie HPIV3. B/HPIV3-IP10 wurde anschließend im Tierversuch evaluiert. In Baumwollratten wurde die Replikation, die Immunogenität und die Virulenz von B/HPIV3-IP10 im Vergleich zu B/HPIV3 und HPIV3 untersucht. Es zeigte sich, dass B/HPIV3 und B/HPIV3-IP10 wesentlich schlechter replizieren als HPIV3, wie es für attenuierte Impfviren erwartet wurde. Erfreulicherweise induzierten B/HPIV3 und B/HPIV3-IP10 trotz ihrer restringierten Replikation mit HPIV3 vergleichbare HPIV3-neutralisierende Antikörpertiter. Im Hinblick auf die T-Zell Proliferation und IFNγ Ausschüttung nach Restimulation zeigte B/HPIV3-IP10 einen Trend zu gesteigerter Immunogenität im Vergleich zu B/HPIV3. Die in einem einzigen Tierversuch gemessenen Unterschiede waren jedoch nicht statistisch signifikant. HPIV3 zeigte im UV-inaktivierten Stimulationsansatz signifikant höhere Werte in der IFNγ Ausschüttung, jedoch nicht in der T-Zell Proliferation. In der Lungenhistologie zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Zahl CD3+ Zellen in den Lungen von B/HPIV3-IP10 infizierten Tieren im Vergleich zur Mock Gruppe und ein Trend zu einem Anstieg im Vergleich zu B/HPIV3 infizierten Tieren. Insgesamt zeigten die Lungen von B/HPIV3-IP10 infizierten Tieren weniger pathologische Veränderungen als die Lungen von B/HPIV3 oder HPIV3 infizierten Tieren. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass B/HPIV3-IP10 gut in vitro repliziert, in Baumwollratten jedoch deutlich attenuiert, aber dennoch mindestens so immunogen wie B/HPIV3 ist. Es gibt erste Anzeichen dafür, dass B/HPIV3-IP10 eventuell immunogener und weniger pathogen ist als B/HPIV3.

This work describes the successful utilization of the reverse genetic system for development of the B/HPIV3 vaccine in relation to the introduction of an immunomodulatory gene. Based on cDNA, a B/HPIV3 mutant with an additional IP10-gen was generated (B/HPIV3-IP10). IP10 is a chemokine that shows protective and immune-stimulating effects in viral respiratory tract infections. B/HPIV3-IP10 successfully expressed the HPIV3 protein, which was replicated in vitro as well. B/HPIV3-IP10 was subsequently evaluated in animal experiments using the cotton rat. Replication, immunogenicity and virulence of B/HPIV3-IP10 (compared to B/HPIV3 and HPIV3) were investigated. In vivo it was shown that B/HPIV3 and B/HPIV3-IP10 replicate much more poorly than HPIV3, as expected for a live attenuated vaccine virus. B/HPIV3 and B/HPIV3-IP10 induced comparable HPIV3-neutralizing antibody titers despite their restricted replication. In view of the T-cell proliferation and IFNγ secretion after restimulation B/HPIV3-IP10 showed a trend towards enhanced immunogenicity in comparison to B/HPIV3. However, the values measured in an animal trial were not statistically significant. Using the UV-inactivated stimulation approach, HPIV3 produced significantly higher values for IFNγ secretion, but not for T-cell proliferation. Lung histology showed a significant increase in CD3+ cells in the lungs of B/HPIV3-IP10-infected rats, when compared to the mock group, and a trend towards an increase when compared to B/HPIV3-infected rats. Overall, the lungs of B/HPIV3-IP10-infected animals showed less pathological changes than the lungs of B/HPIV3 or HPIV3 infected animals. In sum, B/HPIV3-IP10 replicated well in vitro, but was significantly attenuated in Cotton rats and at least as immunogenic as B/HPIV3. This represents the first evidence that B/HPIV3-IP10 is more immunogenic and less pathogenic than B/HPIV3.