IL-18-exprimierende mesenchymale Stammzellen als syngenes Vehikelsystem zur Therapie des Neuroblastoms

Abstract

Beim Neuroblastom handelt es sich mit 8% um den dritthäufigsten Tumor im Kindesalter; trotz intensiver Forschung liegt die 5-Jahres-Überlebensrate in INSS-Stadium 4 – in dem sich etwa 40% aller Patienten bei Diagnosestellung befinden – bei lediglich 31%. Die gezielte, intratumorale Applikation antineoplastischer Zytokine wie IL-18 mittels mesenchymaler Stammzellen stellt einen neuen, vielversprechenden Therapieansatz dar, der in der Lage ist typische Probleme der Chemotherapie wie einen geringen und unspezifischen Antitumoreffekt sowie hohe Toxizität zu umgehen. Ziel dieser Arbeit war daher die Etablierung einer IL-18-produzierenden MSC-Zelllinie für die zelluläre Immuntherapie sowie die Untersuchung ihrer Wirkung im syngenen Neuroblastommodell. Als Grundvoraussetzung wurden zunächst erstmals MSC aus dem Knochenmark von A/J-Mäusen gewonnen und charakterisiert. Das kommerziell erhältliche MesenCult-Medium wurde dabei als optimales Medium für die Langzeitkultur dieser Zellen ermittelt. Die spindelförmigen, flachen, fibroblastenartigen mMSC mit prominentem granuliertem Nucleus zeigten im CFU-F Assay das Wachstum in typischen Kolonien; der Anteil der MSC im Knochenmark nahm auch bei A/J-Mäusen mit steigendem Lebensalter ab, während die Qualität ihrer Eigenschaften stabil blieb. Die Differenzierung der mMSC in adipogene und osteogene Zelllinien nach spezifischer Stimulation zeugte von ihrer Pluripotenz. Die Immunophänotypisierung ergab mit MSC anderer Spezies vergleichbare Ergebnisse: die adhäsiven Oberflächenmoleküle CD29, CD44, Sca-1, CD106 waren nachweisbar, hämatopoetische Marker wie CD45, CD117/c-kit und CD31 hingegen nicht. Für die beiden Marker CD90.2 und CD34, für die eine phänotypische Heterogenität beschrieben wird, waren die Signale negativ bzw. erst positiv und dann rückläufig. Durch lipid-basierte Transfektionsmethoden und die Amaxa Nucleofector-Technologie konnten mMSC mit dem mIL-18-Gen im eukaryoten Expressionsvektor pcDNA3.1 transfiziert und eine transiente Expression von mIL-18 gezeigt werden. Der transiente Charakter der Transfektion und die dadurch bedingte kurze Zeitspanne der mIL-18-Expression ließen keine langen Versuchsdauern in in vitro- und in vivo-Experimenten zur Evaluation von Wirkmechanismus und Antitumor-Effekt zu. Daher erfolgte der erfolgreiche lentivirale Gentransfer der MSC mit pPR1-mIL-18 bzw. pPRIEG7-mIL-18 als Transfervektoren und den Helferplasmiden pMDLg, pRRE und pRSV. Im Zellkulturüberstand transfizierter Zellen konnte mittels ELISA 96 h nach Transfektion ein mittlerer mIL-18 Gehalt von 23 pg/ml für pPR1-mIL-18 bzw. 67 pg/ml für pPRIEG7-mIL-18 gemessen werden. Die Transfervektoren enthielten neben dem mIL-18-Gen auch das EGFP-Gen, wodurch die Bestimmung der Transfektionseffizienz mittels FACS und das Verfolgen transfizierter mMSC in situ möglich wurden. Mit Zeocin selektierte Einzelzellkulturen lentiviral transfizierter mMSC waren über lange Kulturdauer mit 97% für pPR1-mIL-18 bzw. 95% für pPRIEG7-mIL-18 stabil positiv für die grüne Fluoreszenz. In einem ersten in vivo-Experiment mit einem NXS2-Tumormodell in A/J-Mäusen zur orientierenden Einschätzung des Einflusses von mIL-18-exprimierenden mMSC wurde eine signifikante Hemmung des Wachstums von NXS2-Tumorzellen in Quantität und Qualität ihres Wachstumsmusters gezeigt. Zusammenfassend zeigen die Daten der vorliegenden Arbeit die prinzipielle Wirksamkeit von IL-18-exprimierenden mesenchymalen Stammzellen zur zielgerichteten und spezifischen Therapie der dritthäufigsten Neoplasie des Kindesalters – des Neuroblastoms.

Neuroblastoma is the most common solid extracranial tumor in children and accounts for around 8% of all childhood cancers. By the time of diagnosis, more than 40% of all patients have progressed to stage 4 which is associated with a 5-year-survival rate of only 31%. Despite great scientific efforts, the prognosis of stage 4 patients has not improved significantly within the last 20 years. Hence, neuroblastoma remains a challenge for pediatric oncology. The site-specific delivery of antineoplastic cytokines such as interleukin-18 via mesenchymal stem cells represents a promising approach to evade typical hindrances of chemotherapy, e.g., low or unspecific antitumor effects and high toxicity. Therefore, the aim of the present thesis was to generate an IL-18-expressing MSC cell line for tumor immunotherapy and to analyse its effects in a syngeneic model of neuroblastoma. First, murine MSC were isolated from the bone marrow of A/J-mice and cultured in MesenCult-Medium. The progenitor cells were characterised by a fibroblast-like round, spindle-shaped and flattened morphology, a prominent granulated nucleus, and their ability to grow in typical formations in a CFU-F assay. While quantity declined with increasing age of the donor mice, quality of A/J-mice-derived MSC was demonstrated to be stable. MSC were shown to differentiate along adipogenic and osteogenic pathways after specific stimulation proving their pluripotent capacity. Importantly, immunophenotypisation showed results comparable to MSC- surface marker patterns of different species. The characteristic pattern included expression of adhesion molecules CD29, CD44, Sca-1, and CD106 but not of hemopoietic cell markers CD45, CD117/c-kit, and CD31. A phenotypic heterogeneity was detected CD34, which was lost during cell culture, and for CD90.2 which was not expressed. Having established a stable mMSC cell culture, we next transfected mMSC with a mIL-18 expression vector (pcDNA3.1). Liposomal or physicochemical transfection methods – including the Amaxa Nucleofector technology – resulted only in a transient mIL-18 expression which did not allow long term in vitro- or in vivo-experiments to evaluate possible antitumor effects and their mechanisms. In contrast, stable transfection of mMSC was accomplished using a lentiviral transfection system. For replication- deficient lentivirus production, HEK293 cells were transfected with the helper plasmids pMDLg, pRRE, and pRSV as well as the transfer vectors pPR1-mIL-18 and pPRIEG7-mIL-18 encoding for EGFP and for IL-18. ELISA performed with the supernatants of lentiviral transfected cells after 96 hours showed a mean yield of mIL-18 of 23 pg/ml in pPR1-mIL-18-transfected cultures and 67 pg/ml in those transfected with pPRIEG7-mIL-18. EGFP expression in transfected mMSC- cultures allowed the measurement of transfection efficiancy by FACS and in situ-tracking of mMSC-mIL-18. Stable expression of pPR1-mIL-18 (97%) and pPRIEG7-mIL-18 (95%) in Zeocin-selected single cell cultures of lentiviral transfected mMSC was detected via EGFP during long term culture. A first in vivo-experiment with the syngeneic NXS2-neuroblastoma cell line in A/J-mice gave a preliminary estimation of the antitumoral effect of mIL-18-expressing mMSC: tumor growth was diminished regarding to both quantity and quality. In summary, our data demonstrate the effectiveness of IL-18-expressing mesenchymal stem cells for a targeted antitumor therapy against the third most common malignancy in children – neuroblastoma.