Entwicklung und Charakterisierung eines humanen kornealen Epithel-Modells auf der Basis einer SV40-immortalisierten Zelllinie zur Bestimmung der okularen Toxizität

Abstract

Tierversuche werden für das Screening von potentiellen Arzneistoffen, sowie Industriechemikalien und – bis Ende 2008 – auch zur Untersuchung von Inhaltsstoffen von Kosmetika hinsichtlich ihrer Wirksamkeit und toxikologischen Unbedenklichkeit eingesetzt. Noch heute ist der in den 1940er Jahren entwickelte Kaninchen-Augen-Irritationstest nach Draize fester Bestandteil der Teststrategie innerhalb der OECD-Prüfrichtlinie 405 zur okulotoxischen Sicherheitsprüfung neuer Substanzen. Der Draize-Test bedeutet nicht nur eine hohe Belastung für das Tier, vielmehr wurde auf internationalen Symposien und in zahlreichen Publikationen darauf hingewiesen, dass die Aussagekraft dieses Tests eingeschränkt ist. Obwohl in den letzten Jahren mit der Ausweitung von Tierersatzverfahren erhebliche Fortschritte erzielt wurden, existiert bis heute keine wissenschaftlich validierte und auf OECD-Ebene anerkannte Alternativmethode zum Draize-Test, die eine Vorhersage von schwach augenreizendem Potenzial (R36) oder der Abwesenheit augenreizender Eigenschaften zulässt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher versucht, das humane Kornea-Epithel – die wichtigste Barriereschicht des vorderen Augenabschnitts – auf der Basis von humanen immortalisierten Zellkulturen als Alternative zum Draize-Test zu rekonstruieren. Der Einfluss verschiedener Kulturbedingungen auf die Gewebsdifferenzierung und auf die Ausbildung einer adequaten Barrierefunktion wurde untersucht. Neben der Hyperproliferation des Epithels konnte ein hemmender Effekt des Serumzusatzes zum Nährmedium auf die Differenzierung des mehrschichtigen Kornea-Epithels gezeigt werden. In den apikalen Gewebsschichten konnten immunzytochemisch und -histochemisch keine Zell-Zell-Kontakte nachgewiesen werden. Demnach bildete sich die Barrierefunktion nur unzureichend aus. Im Gegensatz dazu entwickelten serumfreie Kulturen, die mit hoher Konzentration an Calciumchlorid sowie Hydrocortison, Retin- und Ascorbinsäure supplementiert wurden, ein differenziertes, etwa 50 µm dickes Epithelgewebe. Die Epithelzellen wuchsen in einem soliden Zellverband und differenzierten in einer ausgeprägten Zellschichtung über fünf bis sieben Lagen hin. Oberflächenzellen waren schuppenartig abgeplattet, Flügelzellen waren eng miteinander verzahnt, Interzellularräume traten nur vereinzelt auf. Aufgrund der Ausbildung ausreichender Zell-Zell-Kontakte ergab sich eine hohes elektrisches Widerstandsniveaus, das die serumhaltigen Kulturen um mehr als ein Drittel überstieg. Anhand der Permeabilität hydrophilen Fluoresceins konnte ein linearer Zusammenhang zwischen Permeabilität und epithelialem elektrischen Widerstand (TEER) nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte eine Esteraseaktivität des Epithel-Modells nachgewiesen werden, welche den Einsatz des Modells bei Permeationsstudien möglich erscheinen lässt. Schließlich wurde das Epithel-Modell um eine mittels Glutaraldehyd vernetzte Stromamatrix ergänzt. Durch die ultrastrukturelle Analyse der Zell-Matrix-Grenzschicht konnte erstmals die Ausbildung einer zusammenhängenden Basalmembran sowie der angrenzenden Bowman-Schicht für ein humanes in vitro-Konstrukt nachgewiesen werden.

The human cornea, and in particular the corneal epithelium, provides a transparent barrier for the passage of numerous potentially harmful substances and protects the intraocular tissues. In addition, the epithelium limits the access of exogenous applied pharmaceutical products into the eye. To this day, both the potential eye irritating effects of chemicals and the permeation behaviour of ophthalmologic medications are studied in animal experiments. Until now, several alternative eye irritation tests have been validated and gained regulatory acceptance within the test strategy according to OECD Test Guideline 405. However, despite several efforts for many years, the Draize rabbit eye test could not have been replaced completely and none of the alternative methods allow the classification of moderate to mild irritants. Hence, establishing non-animal methods for the prediction of eye corrosion/irritation is still one of the challenges for the assessment of potentially harmful substances. In the present work an SV40-immortalised human corneal epithelial cell line (HCE) was characterised with respect to its suitability to serve as a model to study both the eye irritation potential of chemicals and the permeation of pharmaceuticals. For this reason different commercialised serum-containing and serum-free media were tested on HCE cells in order to assess the effects of serum and other supplements on different cellular characteristics such as growth, morphology and barrier properties. In detail, epithelial multilayers were subjected to histology for the evaluation of tissue morphology and cell proliferation. Barrier functions were investigated by measuring transepithelial electrical resistance (TEER) as well as the permeation of the hydrophilic marker fluorescein. Since barrier function in the normal cornea is maintained by tight junctions (zonulae occludentes) in the apical corneal epithelium, the expression of ZO-1 as a marker molecule for the presence of tight junctions was studied. The formation of tight-junctions was further investigated using transmission electron micrographs (TEM). It could be shown that high concentrations of serum interfered with cellular differentiation and proliferation. Epithelia cultivated in serum containing medium showed hyperproliferation. Under serum- free culture conditions the layer morphology was comparable to the in vivo situation, epithelial cells stratified without intercellular spaces and vacuolisation. Ultra-structural quality of the KGM+++-models, as studied by TEM, revealed typical corneal features such as surface cell microvilli and intercellular adhesive junctions (numerous tight junctions, and desmosomes). In accordance to TEM results, models cultured serum-free developed a tighter barrier function which was confirmed by measuring its TEER values and tight junction-related proteins. Moreover, KGM+++-models were less permeable for fluorescein than cultured serum-containing. With decreasing TEER values, the permeability of fluorescein increased in linear correlation. Finally, in the context of this work, the esterase activity was detected. KGM+++-model showed metabolic activity. Furthermore, it was possible to expand the epithelium- model by a cross-linked collagen matrix embedded with stromal cells. A basement membrane zone, which comprised numerous hemi-desmosomes, as well as a defined lamina densa, a lamina lucida and a Bowman’s layer, consisting of irregularly-arranged collagen fibres, could be defined.