Transcriptional regulation of chloroplast ascorbate peroxidases in Arabidopsis thaliana

Abstract

In this project, the promoter regions of sAPX (At4g08390) and tAPX (At1g77490) were cloned to pHGWFS 7.0 vector and transform to Arabidopsis thaliana. The constructs allow the analysis of the promoter activities by measuring GFP and GUS. Three independent transformation lines were studied for each promoter in order to study the regulation by a spectrum of environmental stimulus. The promoter of tAPX gene was found to be controlled by chloroplastic H2O2. Application of chemicals blocking photosynthestic electron transport upstream of photosystem I suppressed the tAPX promoter activity. However, methyl viologen causing chloroplast reactive oxygen species production increased the tAPX promoter driven reporter expression. mRNA levels of tAPX in 2cpa, 2cpb, and 2cpa2cpb mutants, which have higher chloroplastic H2O2, were higher than in wild type plants. These results suggest a role of chloroplastic H2O2 in regulating tAPX gene. tAPX promoter activity was also shown to be elevated mechanic wounding. Although wounding caused cytosolic H2O2 production, wounding induction of of tAPX promoter activity was not primarily mediated by H2O2, since wounding in old leaves increased H2O2 but did not change tAPX promoter activity. Other factors, such as cold, drought, very strong high light, jasmonic acid or salicylic acid application, and exogenous feeding of H2O2, etc. made plants accumulate H2O2 in the cytosol, but did not activate the tAPX promoter. Taken these results together, chloroplatic but not cytosolic H2O2 regulate tAPX promoter. tAPX promoter was also shown to be regulated by light in a spectrum specific manner. Long term exposure to dark completely suppressed the activity of the tAPX expression. Exposure of etiolated plants to 8 h white light, blue light, and far red light, but not red light recovered the tAPX promoter activity. These results suggest that chloroplast H2O2 and photoreceptor mediated signals together regulate the tAPX promoter. Promoter truncation assays localized the important regulating region of tAPX promoter to -1295 to -734 bp upstream of translation start site. In silico prediction suggested that ARR2, ARR10, LEC2, SPL3, and SPL8 are putative transcription factors binding and regulating tAPX. Except LEC2, whose mutation caused a lethal phenotype, plants with T-DNA insertion within these genes are analyzed. mRNA levels of tAPX in spl3 and spl8 were shown higher than in wild type plants. Therefore, spl3 and spl8 are likely transcription factors negatively regulating tAPX. sAPX was found less intensively expressed in leaf mesophyll cells. Greater promoter activitywas observed in leaf veins. The promoter activity of sAPX in mesophyll cells and vasculature cells are differently controlled. Promoter was shown up-regulated by light in mesophyll cells, while down-regulated in leaf vasculature. Generally, stresses like cold, drought increases sAPX promoter activity. Block of photosynthetic electron transport suppresses sAPX promoter. The photosynthesis regulation of sAPX promoter was related to ascorbate biosynthesis, as ascorbate biosynthesis is regulated by the carbohydrate availability which is influence by photosynthesis. Promoter truncation assay localized the regulation region of sAPX to be -654 to -408 bp upstream of transcription start site. Further analysis is needed to identify corresponding transcription factors.

In dieser Arbeit wurden die Promoterregionen von sAPX (At4g08390) and tAPX (At1g77490) in den Vektor pHGWFS 7.0 kloniert und in Arabidopsis thaliana transformiert. Diese Konstrukte erlauben die Analyse der Promoteraktivität durch GFP- und GUS Messungen. Für beide Promoter wurden drei unabhängige Transformationslinien auf die Regulation durch ein Spektrum an Umwelteinflüssen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß der Promoter des tAPX Gens durch plastidäres H2O2 kontrolliert wird. Zugabe von Chemikalien, welche den photosynthetischen Elektronentransport oberhalb von Photosystem I blockieren, reprimierten die tAPX Promoteraktivität. Methylviologen, welches die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in Chloroplasten induziert, steigerte die tAPX Promoter-abhängige Reportergenaktivität jedoch. Die mRNS Abundanzen von tAPX in 2cpa, 2cpb und 2cpa2cpb Mangelmutanten, welche erhöhte Konzentrationen an H2O2 in den Chloroplasten aufweisen, waren höher als in Wildtyppflanzen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß plastidäres H2O2 eine Rolle bei der Regulation des tAPX Gens spielt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, daß die Aktivität des tAPX Promotors durch mechanische Verwundung gesteigert wurde. Obwohl diese Verwundung die zytosolische H2O2 Produktion induzierte, ließ sich die gesteigerte tAPX Promotoraktivität nicht ausschließlich auf H2O2 zurückführen, da die Verwundung in älteren Blätter zwar ebenfalls die H2O2 Produktion induzierte, aber die tAPX Promotoraktivität nicht beeinflusste. Andere Faktoren, wie z.B. Kälte, Trockenheit, sehr starkes Licht, Jasmonsäure- oder Salicylsäureapplikation, sowie exogene Zugabe von H2O2, usw. führten zur Akkumulation von H2O2 im Zytosol, aber nicht zur Aktivierung des tAPX Promoters. Zusammengenommen läßt dies darauf schließen, daß plastidäres, aber nicht zytosolisches, H2O2 den tAPX Promoter reguliert. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß der tAPX Promoter auf verschiedene Wellenlängen des sichtbaren Lichts individuell reagiert. Längerfristige Anpassung an Dunkelheit reprimierte die tAPX Expression vollständig. Etiolierte Pflanzen, welche acht Stunden entweder weißem, blauem, dunkelroten Licht ausgesetzt wurden, konnten, im Gegensatz zu rotlichtbehandelten Pflanzen, Ihre Promoteraktivität regenerieren. Diese Resultate legen nahe, daß plastidäres H2O2 und photorezeptorvermittelte Signale gemeinsam den tAPX Promoter regulieren. Promoter Verkürzungsansätze konnten eine für die Regulierung wichtige Region des tAPX Promoters auf -1295 bis -734 bp vom Startcodon lokalisieren. In silico Prognosen ergaben, daß ARR2, ARR10, LEC2, SPL3 und SPL8 potenzielle Transkriptionsfaktoren darstellen, die an den tAPX Promotor andocken und ihn regulieren. Ausgenommen LEC2, dessen Mangelmutante einen lethalen Phänotyp aufweist, wurden T-DNA Insertionslinien von all diesen Genen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß mRNS Abundanzen von tAPX in den beiden Mutantenlinien spl3 und spl8 größer waren als in Wildtyppflanzen. Daher sind wahrscheinlich sowohl spl3 als auch spl8 Transkriptionsfaktoren, welche tAPX Expression negativ regulieren. Die Promoteraktivität von sAPX erwies sich schwächer in Blattmesophyllzellen als in denen der Blattadern, was auf eine unterschiedliche Regulierung schließen läßt. Außerdem konnte gezeigt werden, daß der Promoter im Mesophyll durch Licht induziert wurde, während seine Aktivität in der Vaskulatur durch Licht reprimiert wurde. Grundsätzlich läßt sich sagen, daß Stressfaktoren wie Kälte oder Trockenheit die sAPX Promotoraktivität induzieren, während eine Blockade des photosynthetischen Elektronentransports selbigen supprimiert. Die photosynthetische Regulierung des sAPX Promoters steht im Zusammenhang mit der Ascorbatbiosynthese, da diese von der Präsenz von Kohlenhydraten, welche durch die Photosynthese bereitgestellt werden, abhängt. Durch Analysen mit verkürzten Promotersequenzen konnte die für die Regulation der sAPX notwendige Region auf -654 bis -408 bp vom Startcodon lokalisiert werden. Weitere Analysen zur Identifizierung der korrespondierenden Transkriptionsfaktoren sind notwendig.