Charakterisierung des doppelkonsomen Rattenstamms MWF-6SHR8SHR zur Analyse der Albuminurie-QTL auf Chromosom 6 und Chromosom 8 bei der MWF-Ratte

Abstract

Chronische Nierenerkrankungen (cNE) stellen aufgrund ihrer steigenden Prävalenz eine zunehmende Herausforderung für unser Gesundheitssystem dar. Ihre Genese ist vielschichtig. Insbesondere ein Diabetes mellitus und arterieller Bluthochdruck sind mit einer erhöhten cNE-Rate assoziiert. Zahlreiche Studien belegen zudem den Einfluss genetischer Suszeptibilitätsfaktoren. Die Ausscheidung einer pathologisch erhöhten Albuminkonzentration im Harn hat sich als wichtiger prognostischer Marker für cNE erwiesen. Gleichzeitig konnte eine Assoziation der Albuminurie (UAlb) mit kardio- und cerebrovaskulären Erkrankungen, sowie der Gesamtmortalität und zwar auch unabhängig von zusätzlichen Risikofaktoren in der Allgemeinbevölkerung nachgewiesen werden. Dies bekräftigt die wissenschaftliche Relevanz des komplex vererbten Merkmals UAlb. Die Identifizierung der genetischen Grundlagen der UAlb birgt neue Erkenntnisse über den Pathomechanismus chronischer Nierenerkrankungen. Der Inzuchtrattenstamm Munich Wistar Frömter (MWF) weist einen milden Hypertonus und eine progressive UAlb auf. Wie beim Menschen wird die UAlb bei ihm komplex genetisch beeinflusst. Daher stellt die MWF-Ratte für genetische Untersuchungen einen vielversprechenden Modellorganismus dar, zu dem die hypertensive aber nierengesunde spontaneously hypertensive rat (SHR-Ratte) einen geeigneten Kontraststamm darstellt. Ab der 8. Lebenswoche tritt bei MWF eine pathologische UAlb auf (18,1±1,9 mg/24h), die ab der 18. Woche nephrotische Grenzwerte überschreitet. In Kosegregations- und Kopplungsanalysen zwischen MWF und SHR haben sich insbesondere die quantitative trait loci (QTL) auf Rattenchromosom (RNO) 6 und RNO8 für die UAlb, strukturelle Nierenschädigung und Glomerulianzahl bei MWF von Bedeutung erwiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung beider QTL sowie deren Interaktionen anhand des doppelkonsomen Stamms MWF-6SHR8SHR untersucht. Dieser weist RNO6 und RNO8 des nierengesunden SHR-Stamms im MWF-Genom auf und wurde im Altersverlauf von 4 bis 52 Wochen phänotypisch hinsichtlich der UAlb, Nierenhistologie, des systolischen Blutdrucks (SBD) und molekularer Marker charakterisiert. Die Ergebnisse wurden mit den Parentalstämmen MWF und SHR, sowie mit den einzelkonsomen Stämmen MWF-6SHR und MWF-8SHR verglichen. Erstaunlicher Weise konnte die UAlb nicht nur ab der 8. Woche im Vergleich zu MWF und MWF-8SHR und ab der 12.Woche zu MWF-6SHR signifikant reduziert werden (p<0,0001). Die UAlb zeigte sich langfristig und vollständig eliminiert und war ab der 14. Woche zusätzlich signifikant geringer als bei SHR-Ratten (1,9±0,3 vs. 0,6±0,04 mg/24h, p<0,0001). Diese Befunde sind umso interessanter, da MWF-6SHR8SHR-Ratten der 24. Woche einen mit SHR vergleichbaren und zu MWF signifikant höheren SBD aufwiesen (169,1±1,7 vs. 175,3±2,8 vs. 145,1±1,1 mmHg). Dies belegt eindrücklich die Blutdruckunabhängigkeit der UAlb bei MWF. Gleichzeitig trat eine Reduktion histologischer Schädigungsmarker (GSI, TDI, RIF) im Vergleich zu MWF auf. Zudem konnten diese Parameter zu MWF-8SHR deutlich verbessert werden (p<0,007) und auch im Vergleich zu MWF-6SHR waren glomeruläre Nierenschäden signifikant gemindert (p<0,004), obwohl beide Einzelkonsomen bereits eine zu MWF signifikante UAlb-Reduktion zeigten. Die verbesserte Nierenmorphologie spiegelte sich zudem in der Expression von Kollagen III und NGAL wider. Sowohl Kollagen III-, ein Marker der renalen Fibrose, als auch NGAL-mRNA, v. a. ein Marker tubulärer Nierenschäden, wurden auf signifikant niedrigerem Niveau exprimiert als bei MWF und MWF-8SHR (p<0,03). Darüber hinaus konnte ein möglicher Zusammenhang zwischen der UAlb und Nierenmorphologie bei MWF zur Anzahl oberflächlicher Glomeruli aufgezeigt werden. Diese liegen subkapsulär und sind für die MWF-Ratte spezifisch. Die Anzahl subkapsulärer Glomeruli konnte bei MWF-6SHR8SHR im Vergleich zu MWF und zu den Einzelkonsomen signifikant verringert werden (p<0,0001). Der Vergleich von männlichen und weiblichen Tieren des doppelkonsomen Stamms konnte belegen, dass weiterhin ein sexueller Dimorphismus hinsichtlich der UAlb auf niedrigerem Niveau bestehen bleibt und die bei MWF-Weibchen milderen Nierenschäden durch die gleichen QTL auf RNO6 und RNO8 wie bei MWF-Männchen beeinflusst werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine komplexe Interaktion zwischen den auf RNO6 und RNO8 detektierten QTL hin, die eine Reduktion der UAlb im Vergleich zu MWF als auch SHR-Ratten bewirkt. Diese führten zu einer vollständigen Eliminierung des albuminurischen Phänotyps bis ins hohe Alter (52 Wochen) trotz Persistenz weiterer UAlb-QTL im MWF-Genom. Die Identifizierung der zugrunde liegenden Gene birgt neue Erkenntnisse über die Mechanismen der komplex regulierten Plasmafiltration in der Niere und damit der Pathogenese von cNE beim Menschen. Dies eröffnet individualisierte therapeutische oder präventiv-therapeutische Möglichkeiten für die Humanmedizin.

Chronic kidney diseases (CKD) are an increasing challenge to our health care system. Their genesis is complex. In particular, diabetes mellitus and arterial hypertension are associated with an increased risk of CKD. Numerous studies also demonstrated the influence of genetic susceptibility factors. Excretion of an increased amount of albumin in urine has proved to be an important prognostic marker for CKD. At the same time, an association of elevated urinary albumin excretion (UAE) with cardio- and cerebrovascular diseases and overall mortality has been demonstrated in the general population. This reinforces the scientific relevance of the complexly inherited trait UAE. The identification of the genetic background of UAE promises new insights into the pathogenesis of chronic kidney disease. Similar to humans the inbred rat strain Munich Wistar Frömter (MWF) shows a genetically influenced moderate hypertension and a progressive UAE. In 8 week old MWF-males a pathologically elevated UAE occurs (18.1 ± 1.9 mg/24 h) that exceeds the nephrotic threshold at 18 weeks of age. In comparative genetic segregation and linkage analyses between MWF and spontaneously hypertensive rats (SHR) two main quantitative trait loci (QTL) on rat chromosome (RNO) 6 and RNO8 were found to be relevant for UAE, kidney damage and an increased amount of superficial glomeruli in MWF rats. In the present study, the importance of both QTLs and their interactions were investigated by characterization of the double-consomic rat strain MWF-6SHR8SHR. In this strain, RNO6 and RNO8 from SHR were introgressed into the isogenic background of MWF. Between the ages of 4 to 52 weeks, male and female double-consomic rats were investigated with regard to the phenotypic traits UAE, renal structural damage and systolic blood pressure (SBP). The results were compared with the parental strains MWF and SHR and the consomic strains MWF-6SHR and MWF-8SHR. Surprisingly, the double-consomic MWF-6SHR8SHR rat strain shows not only reduced UAE compared to MWF and the consomic strains MWF-8SHR and MWF- 6SHR after 8 and 12 weeks, respectively, but also a complete elimination of UAE after 14 weeks. Furthermore, MWF-6SHR8SHR rats showed significantly lower UAE than SHR rats (1.9 ± 0.3 vs. 0.6 ± 0.04 mg/24 h, p <0.0001). These findings are particularly interesting as MWF-6SHR8SHR rats showed a systolic blood pressure (SBP) comparable to SHR rats but significantly higher than MWF rats at the age of 24 weeks (169.1 ± 1.7 vs. 175.3 ± 2.8 vs. 145.1 ± 1.1 mmHg). This demonstrates impressively the independence of blood pressure and UAE in MWF rats. At the same time, reduced histological damage was found compared to MWF rats (analyzed by GSI, TDI and RIF). Moreover, these parameters were significantly improved compared to MWF-8SHR (p <0.007) and also glomerular damage was significantly reduced compared to MWF-6SHR (p <0.004), although both consomic strains already showed a significant reduction compared to MWF rats. The improved kidney morphology is also reflected in the expression of collagen III and NGAL. Both collagen III-mRNA (a marker of renal fibrosis) as well as NGAL-mRNA (mainly a marker of tubular kidney damage) were expressed at significantly lower levels in the double-consomic MWF-6SHR8SHR rat strain than in MWF and MWF-8SHR (p <0.03). The results suggest a connection between UAE levels and the number of superficial glomeruli, that are specific to MWF rats. The number of subcapsular glomeruli in MWF-6SHR8SHR was significantly reduced compared to MWF and the consomic strains (p <0.0001). The comparison of male and female animals of the double-consomic strain proved that a sexual dimorphism with regard to UAE remains and that UAE is influenced by RNO6 and RNO8 in male as well as in female MWF rats. The results of this study suggest a complex interaction between the QTLs located on RNO6 and RNO8, which causes a reduction of UAE in MWF-6SHR8SHR rats compared to MWF and SHR rats. Elimination of both QTLs led to a complete suppression of the albuminuric phenotype in old double-consomic rats (52 weeks) despite the persistence of at least nine other UAE-QTLs in the MWF genome. The identification of the underlying genes allows new insights into the mechanisms of complexly regulated plasma filtration in the kidney and thus the pathogenesis of CKD in humans. This offers individualized therapeutic or preventive possibilities for human medicine.