Etablierung einer Mikrowell-Technologie zur Testung der Suszeptibilität von Myelomzellen auf Therapeutika sowie auf die Abhängigkeit von Zell-Zell-Interaktionen

Abstract

Das Multiple Myelom (MM) ist eine hämatologische Neoplasie, für deren Therapie zahlreiche Substanzen zur Verfügung stehen. Etablierte prädiktive Marker für das individuelle Therapieansprechen fehlen. Eine personalisierte Therapieentscheidung könnte helfen, das klinische Outcome der Patient*innen zu verbessern. Die vorliegende Arbeit soll überprüfen, ob mittels der in-vitro Therapeutika-Test-Plattform der Firma CellPly eine Prädiktion des patientenindividuellen in-vivo Ansprechens auf einzelne Therapeutika möglich ist. Innerhalb der CellPly-Plattform können Substanzen und Antikörper zu Zellkulturen automatisiert gegeben und ausgewertet werden. Dies ermöglicht eine Testung von bis zu 16 verschiedenen Konditionen pro Durchlauf mittels Fluoreszenzdetektion von Tumorzellen sowie der Apoptoserate mit anschließender bildbasierter Analyse. Die Inkubation der Zellen mit den Medikamenten findet in einem speziellen Microfluid-Device statt, welches über 16 Kanäle mit je 1200 Mikrowells verfügt. Diese können individuell ausgewertet werden. Zur Evaluation der Methode wurden zunächst die MM-Zelllinie U266 und die Stroma- Zelllinie HS-5 untersucht und die Methodik etabliert. Anschließend wurden primäre MMZellen von 22 Patient*innen untersucht. Nach der Isolation der mononukleären Zellen wurden die MM-Zellen mit einem anti-CD138-Antikörper markiert und mit verschiedenen Konzentrationen der Substanzen Bortezomib, Melphalan, Dexamethason, Daratumumab, Elotuzumab und eines SUMO-Inhibitors (SUMOi) bis zu 48h inkubiert. Außerdem wurde mittels Markierung von NK-, T- und Stromazellen des Knochenmarkes (BMMSC) deren Einfluss auf die Viabilität der MM-Zellen mituntersucht. Die beiden Zelllinien zeigten eine gute Viabilität innerhalb der CellPly-Plattform, wenn auch die der HS-5 niedriger war. In der Ko-Kultur zeigten beide eine signifikant schlechtere Viabilität. Die Viabilität der primären MM-Zellen zeigte sich über 24h gut, nach 48h lag sie bei Anwendung des automatischen Protokolls weiterhin im auswertbaren Bereich. Für Bortezomib, Melphalan, SUMOi und Dexamethason ließen sich gute Dosis-Wirkungsbeziehungen darstellen und ideale Response-Testparameter ermitteln. Für Daratumumab, Elotuzumab und Lenalidomid ließen sich nicht genug verwertbare Daten generieren, so dass hier keine signifikante Wirkung gemessen werden konnte. Für NK- und T-Zellen ließ sich ein signifikant negativer Einfluss auf das MM-Überleben in-vitro eruieren. BMMSC lagen in zu geringer Menge im Knochenmark vor für eine weitere Analyse. Die Hinzunahme der klinischen Daten der Patienten zu den in-vitro-Ergebnissen zeigte keine signifikanten Korrelationen. Mittels der CellPly-Plattform konnte die in-vitro Response für die Substanzen Bortezomib, Melphalan, SUMOi und Dexamethason dargestellt werden, zudem war der Einfluss von NK- und T-Zellen messbar. Die prädiktive Wertigkeit der in-vitro Ergebnisse zum in-vivo Outcome muss in einer größeren Patientenkohorte evaluiert werden.

Multiple Myeloma (MM) is a hematological malignancy with many therapeutic options available. There is a lack of established predictive markers for the individual response to the different drugs. Personalized treatment decisions could improve the clinical outcomes of patients. This project shall evaluate if it is possible to predict individual in-vivo responses to several drugs by using the in-vitro drug testing-platform from CellPly. Within the CellPly platform, substances and antibodies can be added to cell cultures in an automated manner. This allows testing of up to 16 different conditions per run by fluorescence detection of tumor cells as well as the apoptosis rate by image-based analysis. The incubation of the cells with the drugs takes place in a special microfluid device, containing 16 channels. Each channel includes 1200 microwells that can be analyzed individually. To evaluate the method, the MM-cell-line U266 and the stromal-cell-line HS-5 were examined and the automated preparation of cells by the machine was established. Subsequently, primary MM cells from 22 patients were tested. Mononuclear cells were isolated by Ficoll, MM cells were labeled with an anti-CD138 antibody and incubated with different concentrations of bortezomib, melphalan, dexamethasone, daratumumab, elotuzumab and a SUMO inhibitor (SUMOi) for up to 48h. In addition, by labeling NK-, Tand bone marrow stromal cells (BMMSC), their influence on MM cell viability was investigated. Both cell lines showed good viability within the CellPly platform, although that of HS-5 was lower. In co-culture, both showed significantly worse viability. The viability of the primary MM cells was shown to be good over 24h and remained in the evaluable range after 48h due to application of the automated protocol. For bortezomib, melphalan, SUMOi and dexamethasone good dose-response relationships were shown, and ideal response test parameters were determined. There was no statistically significant dose-dependent effect on MM-cells seen for lenalidomide, daratumumab and elotuzumab. Regarding NK- and T-cells, a significant negative effect on MM viability was shown in-vitro for both cell types. Due to a low proportion of BMMSC in the bone marrow samples further analysis was not possible. There were no significant correlations between the clinical data of the patients and the in vitro results. The CellPly platform could analyze the susceptibility of MM cells to bortezomib, melphalan, dexamethasone and SUMOi. Besides, the effect of NK- and T-cells could be measured. Future work will explore a larger cohort to investigate the correlation of the invitro data with the patient response and outcome.