Generierung monoklonaler Antikörper gegen SARS-CoV-2 und ZIKV durch In- Vitro-Immunisierung mittels zellpermeabler virusähnlicher Partikel als Antigenträger

Abstract

SARS-CoV-2 und ZIKV sind zwei neu auftretende Krankheitserreger. Ein wesentliches Werkzeug für die Charakterisierung des viralen Lebenszyklus sind Antikörper. Monoklonale Antikörper (MAbs) sind ein immunologisches Instrument mit vielfältigen Anwendungen in Forschung, Diagnose und Therapie. Die konventionelle Herstellung von MAbs ist jedoch zeitaufwändig, kostspielig und erfordert die Verwendung vieler Tiere und geht außerdem mit einer Belastung der Versuchstiere einher. Alle tierexperimentell arbeitenden Wissenschaftler sind sich der großen Verantwortung bewusst, die sie für das Wohlergehen der Versuchstiere tragen. Obwohl Tierversuche in der Forschung unerlässlich sind, besteht Einigkeit darüber, sie auf ein notwendiges Minimum zu beschränken. Als Richtlinie gilt dabei das ethische Prinzip der „3R“: Replace (Vermeiden), Reduce (Verringern) und Refine (Verbessern). Nach dem 3R-Prinzip zielte dieses Projekt darauf ab, SARS-CoV-2 und ZIKV-spezifische monoklonale Antikörper durch In-Vitro Immunisierung zu erzeugen. In diesem Projekt wurden zellpermeable Carrier-Capside benutzt, die einerseits das Zellpermeabilität vermittelnde TLM-Peptid beinhalten und im Bereich des Spike tips einen insertierten Strep-tag aufweisen. Dies ermöglicht die flexible Beladung mit Antigenen, die an Streptavidin fusioniert sind, so dass zellpermeable VLPs entstehen, die an ihrer Oberfläche mit Antigen beladen sind. Durch die Verwendung dieser Plattformtechnologie, die einen effizienteren Antigentransfer und eine robustere Immunantwort induziert als eine konventionelle Immunisierung mit dem freien Antigen, soll die geringere Effizienz der In-Vitro Immunisierung kompensiert werden. Rekombinante Antigene und VLPs konnten in E. coli hergestellt und durch Affinitätschromatographie gereinigt werden. Dichtegradientenzentrifugation und Elektronenmikroskopie zeigten den Aufbau der vlps und die Beladung mit den Antigenen. Diese Antigen-beladenen Partikel wurden zur In-Vitro Immunisierung von Milz-abgeleiteten Lymphozyten verwendet. Bei der In-Vvitro Immunisierung erfolgt die Immunisierung nicht im Tier, sondern in Kultur. Nach 4 Tagen war die Immunisierung abgeschlossen und die Zellen bereit für die Fusion mit Myeloma Zellen, um Hybridoma herzustellen. Wir haben ein Elektrofusionsprotokoll zur Fusion von B-Zellen mit Myelomzellen erstellt. B-Zellen und Myelomzellen werden über Komplexe aus Biotin- und Streptavidin–gekoppeltem Antigen verknüpft. Dazu wurde eine Biotinylierung von Oberflächenproteinen der Sp2/0-Ag14 Zellen durchgeführt. Fusionsproteine bestehend aus monomerem Streptavidin und ZIKV.E oder spike RBD können an das Biotin auf der Zelloberfläche binden. Auf der anderen Seite kann das Antigen an Oberflächen von B-Zellen binden. Nach Inkubation der B-Zellen mit Myeloma Zellen entstehen Verbindungen zwischen beiden Zellen, was zu einer effizienten Fusion führt. Anschließend erfolgt die Elektrofusion der Zellsuspension in einem Puffer niedriger Ionenstärke. Die monoklonalen Antikörper werden von den Zellen an das Medium abgegeben und können daraus in großen Mengen in vitro gewonnen werden. Durch diesen Ansatz wurden SARS-CoV2-Spike-RBD- und ZIKV.E-spezifische Antikörper-Mabs in vitro erhalten. Die Antikörperbindung wurde durch die Oberflächenplasmonresonanz auf einem Biacore-System charakterisiert. Somit können diese Antikörper zum Nachweis von SARS-CoV2-Spike bzw. ZIKV.E durch Western-Blot- oder Immunfluoreszenzmikroskopie und zur Quantifizierung von SARS-CoV2 S oder ZIKV.E durch spezifische ELISAs verwendet werden. In Übereinstimmung mit dem 3R-Prinzip haben wir ein Protokoll zur In-Vitro Immunisierung und Erzeugung monoklonaler Antikörper entwickelt. Es wurden hochspezifische Antikörper zum Nachweis und zur Quantifizierung von entweder SARS-CoV2-Spike oder ZIKV-Hüllprotein erhalten.

ZIKV and SARS-CoV-2 are two emerging pathogens. For detailed characterization of the viral life cycle, specific monoclonal antibodies for viral proteins are required. Monoclonal antibodies (MAbs) are an established immunological tool with multiple applications in research, diagnosis and therapy. However, the conventional production of MAbs is time-consuming, costly and requires the use of many animals. The 3R principle aims to avoid animal experiments altogether (replacement), to limit the number of animals (reduction) and their suffering (refinement). According to the 3R principle, this project aimed to generate SARS-CoV-2 and ZIKV-specific monoclonal antibodies by in vitro immunization. The HBV capsid is highly immunogenic and helps to trigger a strong B-cell response against the antigens. In this project, TLM-HBV core fused to Streptavidin serves as membrane permeable antigen carrier and monomeric streptavidin fused to RBD of SARS-CoV-2 or ZIKV envelope (E) is used as cargo. TLM-HBV core served as antigen carrier. Recombinant antigens and vlps could be produced in E. coli and purified by affinity chromatography. Density gradient centrifugation and electron microscopy revealed the assembly of the vlps and the loading with the respective antigens. These antigen-loaded particles were used for immunization of spleen-derived lymphocytes. We established an electrofusion protocol for fusing B-cells with myeloma partners. This was achieved by Streptavidin-mediated coupling of B-cells to biotinylated myeloma cells to generate hybridomas secreting functional monoclonal antibodies. By this approach SARS-CoV-2 spike-RBD and ZIKV.E specific antibodies mabs were obtained in vitro. Antibody binding was characterized by surface plasmon resonance on a Biacore system. Thus, these antibodies can be used for detection of SARS-CoV-2 spike or ZIKV.E, respectively by western blot or immunofluorescence microscopy and for quantification of SARS-CoV-2 or ZIKV.E by specific ELISAs. In line with the 3R principle we developed a protocol for in vitro immunization and generation of monoclonal antibodies. Highly specific antibodies for detection and quantification of either SARS-CoV-2 spike or ZIKV envelope protein were obtained.