Auswirkungen des histologischen Grades und des c-kit-Mutationsstatus auf das Proteinexpressionsprofil kaniner kutaner Mastzelltumoren

Abstract

Die am häufigsten diagnostizierte Neoplasie der Haut des Hundes ist der kutane Mastzelltumor (MZT). Entsprechend seinem histologischen Zellbild und dem verwendeten Grading-System werden zwei bzw. drei unterschiedliche histologische Grade differenziert. Während Grad 1 bzw. low-grade MZT durch gut differenzierte monomorphe Tumorzellen charakterisiert sind und weder zur Metastasierung noch zur Rezidivbildung neigen, enthalten Grad 3 bzw. high- grade MZT entdifferenzierte, pleomorphe Mastzellen, die häufig metastasieren und rezidivieren. Obwohl Mastzelltumoren, ähnlich wie Mammatumoren, seit längerer Zeit im Mittelpunkt der Forschung stehen, sind molekularbiologische Details, die zu diesem offensichtlichen unterschiedlichen klinischen Verhalten führen, weitgehend unbekannt. Große Hoffnung wurde auf den Stammzellfaktor- Rezeptor KIT und sein Protoonkogen c-kit gelegt, dessen Aktivierung in normalen Mastzellen die Zellproliferation und -reifung sowie die Migration und Degranulation von Zellen steigert. Die Identifikation von aktivierenden Mutationen, wie etwa die Tandemduplikation im Exon 11, ließen dementsprechend einen großen Einfluss auf die Proliferation und Progression von kaninen Mastzelltumoren vermuten. Der direkte Einfluss der c-kit-Mutation auf das Proteinexpressionsprofil mutierter MZT-Zellen wurde bislang jedoch noch nicht analysiert. Darüber hinaus wurden bis heute nur bei circa 12 % aller MZT, bzw. 40 % der Grad 3 MZT entsprechende Mutationen identifiziert. Dies wiederum führt zu der Frage, welche anderen molekularbiologischen Veränderungen das aggressive klinische Verhalten der höhergradigen MZT verursachen. In der vorliegenden Studie wurden deshalb die Proteinexpressionsmuster kaniner kutaner MZT mit unterschiedlichem histologischen Grad (je n=5) bzw. unterschiedlichem c-kit- Mutationsstatus (je n=3) mittels zweidimensionaler differenzieller Gelelektrophorese verglichen und differenziell exprimierte Proteine im Anschluss mittels Massenspektrometrie identifiziert. Tumoren mit unterschiedlichem histologischen Grad unterschieden sich in der Expression von 13 Proteinen. Dabei handelte es sich vorrangig um Stressproteine, mit Zellmotilität assoziierte Proteine und Mastzell-typische Differenzierungsproteine. Eine Validierung der Ergebnisse mit Hilfe weiterer biochemischer Methoden und größerer Fallzahlen wird im Weiteren zeigen, ob das aggressive klinische Verhalten höhergradiger MZT möglicherweise durch die veränderten Expressionsprofile dieser Proteine erklärbar sein könnte. In der Mutationsanalyse, dem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, konnten 15 verschiedene, signifikant differenziell exprimierte Proteine identifiziert werden. Entgegen der Arbeitshypothese fanden sich jedoch keine Proliferations- assoziierten Proteine im differenziellen Proteom. Diese Ergebnisse untermauern die Vermutung, dass der Nachweis der c-kit-Mutation, im Gegensatz zum histologischen Grad, von geringer Relevanz für die Prognose des klinischen Verhaltens kaniner kutaner Mastzelltumoren ist.

Cutaneous mast cell tumors (MCT) are one of the most common skin tumors in dogs. According to their histological appearance and the applied grading- system two or three different histological grades have to be distinguished. Grade 1 or low-grade MCT are characterized by well differentiated monomorphic tumor cells which neither tend to metastasize nor recur. Grade 3 or high-grade MCT are composed of dedifferentiated pleomorphic mast cells which often recur or even metastasize to distant organs. Although mast cell tumors are in the focus of research worldwide molecular details which provide the basis for this different clinical behavior are in most aspects unknown. Studies about KIT, the receptor for stem cell factor, and its proto-oncogene c-kit revealed promising results, as the identification of an activating internal tandem duplication in exon 11 lead to the assumption that KIT activity is of major relevance to MCT proliferation and progression. Impact of c-kit-mutations on the protein expression profile of mutated MCT cells is however unknown. Since recent studies identified c-kit-mutations in only 12 % of all MCT and 40 % of grade 3 MCT, other molecular alterations have to be responsible for the aggressive clinical behavior of grade 3 MCT. Therefore, the present study compared the protein expression patterns of grade 1 and grade 3 MCT (each n=5) and of MCT with or without c-kit-mutation (each n=3) by two-dimensional difference gel electrophoresis. Differentially expressed proteins were identified by mass spectrometry subsequently. Tumors of distinct histological grade differed in the expression of 13 proteins. Most of them are associated with stress resistance, cell motility and mast cell differentiation. Further studies are needed now to evaluate if these modified expressions patterns are responsible for the aggressive clinical behavior of grade 3 MCT. The comparison of c-kit-mutated and non-mutated MCT revealed 15 significantly differentially expressed proteins. Contrary to the second hypothesis no proteins with an association to increased proliferation activity were detectable. These results substantiate the assumption that activating mutations in the proto-oncogene c-kit are of less relevance for clinical behavior than the histological grade.