Changes in peripheral blood PD-1 receptor expression under anti-PD-1 Immune Checkpoint Therapy

Abstract

Immune checkpoint receptors are key regulators of the immune system, especially in autoimmunity and cancer. Programmed Death 1 (PD-1) is one of the most relevant immune checkpoints known and research around it as well as approval of anti-PD-1 monoclonal antibodies has led to a revolution in cancer therapy in the last decade. While trial results and remission rates have been impressive compared to therapies used before, not all patients benefit from immune checkpoint therapy. It is still largely unknown what distinguishes patients who respond to anti-PD-1 inhibition from those who do not, and reliable biomarkers predicting therapy outcomes are urgently needed. We set out to analyse PD-1 expression in peripheral blood immune cells of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and renal cell carcinoma (RCC) patients before and throughout treatment with anti-PD-1 monoclonal antibody Nivolumab to assess whether connections between PD-1 expression and therapy response can be drawn. As the basis for our longitudinal analysis, we established a protocol for whole blood preparation and antibody staining for flow cytometry. PD-1 blockade by Nivolumab poses a challenge in accurately detecting the receptor in flow cytometry. Secondary staining of PD-1 under these conditions has previously been successfully applied on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). We established a staining procedure utilizing a secondary IgG4 antibody and demonstrated that PD-1 staining under Nivolumab therapy can reliably be carried out on whole blood samples that were previously stabilized and frozen. We show that PD-1 expression is significantly higher on immune cells of HNSCC patients compared to RCC patients before and during Nivolumab therapy. We attributed higher PD-1 expression in HNSCC to patients with HPV-positive tumors. Higher PD-1 expression levels at the end of our trial period were associated with the occurrence of immune-related adverse events (irAEs), most distinctly in CD8+ CD38+ activated effector T cells. We compared PD-1 expression in responders and non-responders to Nivolumab therapy and observed elevated levels of PD-1 in T cells of patients with stable disease or partial response to therapy compared to patients with progressive disease. However, our data was non-significant in this regard and larger trials are needed to investigate such associations in RCC and HNSCC patients.

Immun-Checkpoint-Rezeptoren sind entscheidende Regulatoren des Immunsystems, insbesondere bei Autoimmun- und Krebserkrankungen. Programmed Death 1 (PD-1) ist einer der wichtigsten bekannten Immun-Checkpoints und seine Erforschung sowie die Zulassung von Anti-PD-1 monoklonalen Antikörpern hat zu einer Revolution der Krebstherapie im letzten Jahrzehnt geführt. Während Studienergebnisse und Remissionsraten im Vergleich zu vorher genutzten Therapien beeindruckend sind, profitieren nicht alle von Immun-Checkpoint-Therapien. Es ist immer noch weitgehend unbekannt, was Patient*innen, die auf PD-1-Inhibitoren ansprechen von denen unterscheidet, die nicht ansprechen. Es werden deshalb dringend zuverlässige Biomarker für die Voraussage des Ansprechens benötigt. Wir haben in dieser Arbeit die PD-1-Expression in Immunzellen des peripheren Blutes von Patient*innen mit Kopf Hals-Tumoren (HNSCC, engl. head and neck squamous cell carcinoma) und Nierenzellkarzinomen (RCC, engl. renal cell carcinoma) vor sowie während der Therapie mit dem monoklonalen Anti-PD-1-Antikörper Nivolumab untersucht, um einzuschätzen, ob Verbindungen zwischen der PD-1-Expression und dem Therapieansprechen gezogen werden können. Als Grundlage für unsere longitudinale Analyse etablierten wir ein Protokoll für die Aufbereitung von Vollblut-Proben und Antikörper-Färbungen für durchflusszytometrische Messungen. Die PD-1-Blockade durch Nivolumab stellt eine Hürde in der genauen Detektion des Rezeptors mittels Durchflusszytometrie dar. Eine sekundäre Färbung von PD-1 ist bereits erfolgreich auf peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) angewendet worden. Wir etablierten ein Färbeverfahren mit einem sekundären Anti-IgG4-Antikörper und konnten so demonstrieren, dass die Färbung von PD-1 unter Therapie mit Nivolumab zuverlässig auf vorher stabilisierten und gefrorenen Vollblut-Proben durchgeführt werden kann. Wir zeigen, dass die PD-1-Expression auf Immunzellen von HNSCC-Patient*innen vor und während der Therapie mit Nivolumab signifikant höher im Vergleich mit der von RCC Patient*innen ist. Wir konnten die höhere PD-1-Expression HNSCC-Patient*innen mit HPV-positiven Tumoren zuordnen. Höhere PD-1-Expressionslevel am Ende unseres Studienzeitraumes waren zudem mit dem Auftreten von immunvermittelten Nebenwirkungen (irAEs, engl. immune-related adverse events) assoziiert, besonders in CD8+ CD38+ aktivierten Effektor-T-Zellen. Wir verglichen die PD-1-Expression von Respondern und Non-Respondern auf die Nivolumab-Therapie und beobachteten erhöhte PD-1-Werte in T-Zellen von Patient*innen mit Stable Disease oder Partial Response unter Therapie verglichen mit Patient*innen mit Progressive Disease. Jedoch waren unsere Daten in diesem Zusammenhang nicht signifikant und größer angelegte Studien werden benötigt, um solche Zusammenhänge in RCC- und HNSCC Patient*innen gezielt zu untersuchen.