Structural and biochemical characterization of biotechnologically relevant enzymes

Abstract

Climate change, antibiotic resistances and environmental pollution are growing threats. Therefore, finding alternatives for fossil resources and discovery of new pharmaceuticals grows more important every day. Natural compounds and their in vivo production pathways proved to be a possible solution to overcome those problems. Optimized microbial hosts can serve as sustainable production platforms for various compounds as it is done for penicillin since many years. The first research topic of this thesis are borneol dehydrogenases, enzymes which convert borneol to camphor. Enantiomerically pure camphor has numerous applications in cosmetic, pharmaceutical, and chemical industry. Thus, enantioselective borneol dehydrogenases would be an attractive candidate to achieve enantiomerically pure camphor. To better understand the differences of enantioselective and unselective borneol dehydrogenases we solved the structures of two selective borneol dehydrogenases from Salvia rosmarinus and Salvia officinalis using X-ray crystallography and cryo-electron microscopy. The obtained structures were compared to the previously solved structure of the unselective borneol dehydrogenase of Pseudomonas sp. TCUHL1. The second focus of this thesis are terpene synthases, a class of enzymes responsible for the cyclization of linear terpene precursors. The products of terpene synthases are interesting candidates for the chemical and pharmaceutical industry due to their diverse characteristics and properties. Latest advances in genome sequencing enabled the discovery of many new and diverse terpene synthases from various organisms. We report on the discovery of two terpene synthases from Coniophora. puteana, Copu5 and Copu9, that not only have identical product profiles, but also show high yields in an optimized Escherichia coli strain. Main product of both enzymes is (+)-δ-cadinol that has been shown to have cytotoxic effect on MCF7 cells and could be used as a new and sustainable anti-tumor drug. To investigate their properties and gain deeper understanding into their function, we attempted to crystallize and biochemically characterize Copu5 and Copu9.

Klimawandel, Antibiotikaresistenzen und Umweltverschmutzung sind wachsende Bedrohungen. Daher wird die Suche nach Alternativen für fossile Ressourcen und die Entdeckung neuer Arzneimittel von Tag zu Tag wichtiger. Naturstoffe und ihre in-vivo- Produktionswege bieten eine mögliche Lösung dieser Probleme. Optimierte mikrobielle Wirte können als nachhaltige Produktionsplattformen für verschiedene chemische Verbindungen dienen, wie es seit vielen Jahren für Penicillin üblich ist. Der erste Fokus dieser Arbeit sind Terpensynthasen, eine Klasse von Enzymen, die für die Zyklisierung von linearen Terpenvorläufern verantwortlich sind. Die Produkte der Terpensynthasen sind aufgrund ihrer vielfältigen Eigenschaften interessante Kandidaten für die chemische und pharmazeutische Industrie. Jüngste Fortschritte in der Genomsequenzierung ermöglichten die Entdeckung vieler neuer und vielfältiger Terpensynthasen aus verschiedenen Organismen. Wir berichten über die Entdeckung zweier Terpensynthasen aus Coniophora puteana, Copu5 und Copu9, die nicht nur identische Produktprofile aufweisen, sondern auch hohe Ausbeuten in einem optimierten Escherichia coli-Stamm zeigen. Hauptprodukt beider Enzyme ist (+)-δ- Cadinol, das nachweislich eine zytotoxische Wirkung auf MCF7-Zellen hat und als neues und nachhaltiges Antitumormittel eingesetzt werden könnte. Zur Untersuchung ihrer Eigenschaften und um ein tieferes Verständnis ihrer Funktion zu erlangen, haben wir versucht, Copu5 und Copu9 zu kristallisieren und biochemisch zu charakterisieren. Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit sind Borneoldehydrogenasen, Enzyme, die Borneol zu Kampfer umwandeln. Enantiomerenreiner Kampfer hat zahlreiche Anwendungen in der kosmetischen, pharmazeutischen und chemischen Industrie. Daher wären enantioselektive Borneoldehydrogenasen ein attraktiver Kandidat zur Herstellung von enantiomerenreinem Kampfer. Um die Unterschiede zwischen enantioselektiven und unselektiven Borneoldehydrogenasen besser zu verstehen, haben wir die Strukturen zweier selektiver Borneoldehydrogenasen aus Salvia rosmarinus und Salvia officinalis mittels Röntgenkristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie gelöst. Die erhaltenen Strukturen wurden mit der zuvor gelösten Struktur der unselektiven Borneol- Dehydrogenase von Pseudomonas sp. TCU-HL1 verglichen.