The role of antibody-dependent cellular cytotoxicity for IgG1 monoclonal antibody therapy of metastatic colorectal cancer

Abstract

In the context of cancer therapy, natural killer cells (NK cells) may mediate direct tumour lysis upon binding of their Fcg receptors (FcgR) to IgG1 monoclonal antibodies (mAb) targeted at tumour-expressed surface antigens in a process termed antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). Polymorphisms in the FcgRIIIa predominantly expressed by NK cells influence the binding affinity of IgG1 mAbs and in turn their ADCC potential, with the FcgRIIIa-158 V/F single-nucleotide polymorphism being the most extensively studied. In order to elucidate the role of ADCC and FcgRIIIa-158 phenotype in the context of IgG1 mAb therapy, we successfully established a novel setup comprising (1) a flow cytometric FcgRIIIa panel to swiftly determine an individual’s FcgRIIIa-158 phenotype and (2) an experimental model to quantify ADCC activity and immune cell activation in vitro. The FcgRIIIa panel employs an anti-FcgRIIIa clone that only recognises the FcgRIIIa- 158 V allele (MEM-154) in combination with a clone that detects both FcgRIIIa-158 alleles (LNK16). Using the results from melting curve analysis as ground truth, a supervised machine-learning based prediction model computed on the flow cytometry measurements of a training set (n = 39) could be validated with a prediction accuracy > 90% on a test set (n = 52). Importantly, the clinically most relevant distinction between the low- affinity FF phenotype and the high-affinity VF/VV phenotypes was flawless, with the few misclassifications exclusively occurring between the VF and VV phenotypes. Advantages of the FcgRIIIa panel over alternative techniques include its wide applicability, quick turnaround time and low cost. The experimental model based on a 24h co-culture of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with a range of colorectal cancer cell lines treated with two IgG1 mAbs, namely anti-EGFR cetuximab and/or anti-PDL1 avelumab, could be shown to reliably detect both in vitro ADCC activity and NK cell activation. Experimental readouts were generated using a lactate dehydrogenase release assay together with a flow cytometry panel. In line with the literature, the strength of ADCC activity correlated with the expression (EGFR, PDL1, MICA/B, CD137L) or absence (HLA-A/B/C) of surface markers on tumour cells. These methods were applied to PBMCs derived from 55 patients with RAS and BRAF wild-type metastatic colorectal cancer receiving chemotherapy with cetuximab and avelumab combination therapy within the context of the single-arm multi-centre phase-II FIRE6 clin- ical trial. While FcgRIIIa-158 phenotype and NK cell activation strongly correlated with in vitro ADCC activity, no benefit could be observed for either of these parameters with respect to clinical outcome measures such as response to treatment or progression-free survival.

Natürliche Killerzellen (NK Zellen) können direkte Zelllyse mittels des Mechanismus der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (engl. ADCC) betreiben, indem sie mit ihren Fcg-Rezeptoren (FcgR) an IgG1 monoklonale Antikörper (mAk) binden, die gegen exprimierte Antigene auf der Oberfläche der Tumorzellen gerichtet sind. Polymorphismen des FcgRIIIa, der sich hauptsächlich auf NK Zellen findet, beeinflussen die Bindungsaffinität für IgG1 mAk und damit das ADCC Potenzial. Unter diesen stellt der FcgRIIIa-158 V/F Einzelnukleotid-Polymorphismus den wissenschaftlich am besten untersuchten dar. Um die Rolle von ADCC und FcgRIIIa-158 Phänotyp für IgG1 mAk-basierte Therapien zu klären, wurde ein experimentelles Setup entwickelt, das aus (1) einem FcgRIIIa Durchflusszytometrie-Assay und (2) einem Modell zur in vitro Quantifizierung der ADCC-Aktivität und Aktivierung von Immunzellpopulationen besteht. Der FcgRIIIa Assay basiert vorrangig auf einem anti-FcgRIIIa Klon (MEM-154), der ausschließlich das FcgRIIIa-158 V Allel erkennt, unter gleichzeitiger Verwendung eines zweiten Klons (LNK16), der beide FcgRIIIa-158 Allele bindet. Aus diesen Messdaten wurde mit Hilfe eines Trainings-Set (n = 39) ein Vorhersagemodell berechnet und anschließend mit einer Genauigkeit von > 90% für ein Test-Set (n = 52) validiert. Dabei gelang die klinisch relevanteste Unterscheidung des FF Phänotyps mit niedriger Bindungsaffinität von den VF und VV Phänotypen mit hoher Bindungsaffinität zweifelsfrei in allen Fällen. Fehlklassifikationen traten ausnahmslos zwischen den Phänotypen VF und VV auf. Die Vorteile des entwickelten FcgRIIIa Assay gegenüber alternativen Methoden bestehen aus einer breiten Anwendbarkeit, kurzer Umlaufzeit und geringen Kosten. Eine zuverlässige Detektion von in vitro ADCC-Aktivität und Aktivierung von NK Zellen konnte durch ein Kokultur-Modell von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (engl. PBMCs) mit kolorektalen Krebszelllinien unter Zugabe eines anti-EGFR (Cetuximab) und anti-PDL1 (Avelumab) IgG1 mAk erreicht werden. Experimentelle Werte wurden mittels der Messung von Laktatdehydrogenase-Freisetzung und einem Durchflusszytometrie-Assay quantifiziert. Im Einklang mit der Literatur wurde eine Korrelation zwischen der Stärke der ADCC-Aktivität und der Expression (EGFR, PDL1, MICA/B, CD137L) bzw. des Fehlens (HLA-A/B/C) von Oberflächenmarkern auf den Krebszellen gefunden. Im Rahmen der multizentrischen Phase II FIRE6 Studie wurden die entwickelten Methoden an PBMCs von 55 Patienten mit RAS und BRAF Wildtyp metastatischem kolorektalen Karzinom unter Chemotherapie und Kombinationstherapie von Cetuximab und Avelumab getestet. Obwohl der FcgRIIIa-158 Phänotyp und die Aktivierung von NK Zellen mit der gemessenen in vitro ADCC-Aktivität korrelierten, wurde keine prognostische Relevanz dieser Parameter in Hinblick auf die klinischen Ergebnisgrößen des Therapieansprechens und progressionsfreien Überlebens festgestellt