Metabolische Wirkungen des ersten nicht-peptidischen Angiotensin II Rezeptor Typ 2 Agonisten

Abstract

Das Renin-Angiotensin-System (RAS) stellt eines der wichtigsten Systeme zur Regulation der kardiovaskulären Homöostase und des Blutdruckes des Körpers dar. Das Angiotensin II übt dabei seine Effekte über zwei verschiedene Rezeptor-Subtypen, den AT1-Rezptor (AT1R) und den AT2-Rezeptor (AT2R), aus. Die Rolle des AT1R in der Entwicklung der Insulinresistenz (IR) ist weitestgehend untersucht und es ist bekannt, dass AT1R-Blocker (ARBs) die Glukoseintoleranz und Insulinempfindlichkeit verbessern. Einige ARBs sind zusätzlich in der Lage, partiell den Peroxisom-Proliferator-Aktivierten- Rezeptor-gamma (PPARgamma) zu aktivieren, was zusätzliche deren anti- inflammatorische Eigenschaften erklären könnte. Über die metabolische Rolle des AT2R ist relativ wenig bekannt, wobei diese zudem teilweise konträr diskutiert wird. Die vorliegende Arbeit soll daher die funktionelle Signifikanz des AT2R in der Entwicklung der IR und der Fettgewebsinflammation aufklären. Hierfür wurde der erste nicht-peptidische AT2R-Agonist Compound 21 (C21) bei in-vitro Zellmodellen mit 3T3-L1 Adipozyten und THP-1 Makrophagen sowie bei einem Diät-induzierten Adipositas (DIO)-Modell der Maus eingesetzt. Die AT2R-Stimulation mit C21 (1 µM) reduzierte signifikant die TNF-alpha induzierte in-vitro Inflammation durch die Reduktion des IL-6 Proteins in differenzierten Adipozyten. Ausserdem wurde die Adiponektin Protein-Expression durch TNF-alpha Behandlung signifikant reduziert, während die Parallelbehandlung mit C21 die Spiegel des anti-inflammatorischen Adiponektins teilweise wiederherstellte. Die Effekte waren AT2R-spezifisch, da die Blockade des AT2R mit dem AT2R-Blocker PD123319 zum Verlust der C21-Effekte führte. Weiterhin führte die C21-Behandlung zu einer signifikanten Reduktion der basalen pro-inflammatorischen Leptin-Produktion sowie zu einer erhöhten anti- inflammatorischen IL-10 mRNA-Expression. Dabei besaß C21 (0,1 bis 1 µM) keinen Einfluss auf die PPARgamma-Aktivität und induzierte folglich auch nicht die Adipozytendifferenzierung. Die THP-1 Makrophagen wurden für die in-vitro Inflammation mit LPS behandelt. Dabei führte die Parallelbehandlung mit C21 zu einer signifikanten Reduktion von IL-6. Der Effekt blieb unter AT2-Blockade mit PD123319 aus. Weiterhin erhöhte C21 das basale IL-10 und reduzierte die LPS-induzierte MCP-1 mRNA-Expression. Für das DIO-Modell wurden Wild-Typ (WT; C57Bl-6) und AT2R-Knockout (AT2R-KO) Mäuse entweder mit einer Hochfett-Diät (HFD) oder einer Kontroll-Niedrigfett-Diät (LFD) (60% kcal aus Fett bzw. 10% kcal aus Fett) zur Induktion einer Adipositas und metabolischer Veränderungen über 10 Wochen gefüttert. Anschließend wurden die Tiere (n=10 pro Gruppe) nach folgendem Protokoll zusätzlich zur Diät über 4 Wochen behandelt: Der AT2R- Agonist C21 (0,3 mg/kg KG i.p.), der ARB Valsartan (3 mg/kg KG i.p.), die Kombination C21 / Valsartan (0,3 / 3 mg/kg KG i.p.), das Antihypertonikum Hydralazin (250 mg/L im Trinkwasser) oder Vehikel. Die Glukosetoleranz (GT) und Insulinempfindlichkeit (IS) wurde mit Standard-GTTs und -ITTs bestimmt. Die HFD reduzierte signifikant die GT und IS, wobei diese jeweils durch die C21-Behandlung signifikant verbessert werden konnten. Die GT wurde ebenfalls durch die Valsartan-Behandlung verbessert. Des Weiteren führte die C21-Behandlung zu einer signifikanten Reduktion von TNF-alpha, Resistin und der Triglyzeride im Serum sowie zu einer Erhöhung der insulin-sensitivierenden Inkretine GLP-1 und GIP. In Übereinstimmung mit den in-vitro Ergebnissen wurden ebenfalls die Adiponektin und IL-10 Serumspiegel durch C21-Behandlung jeweils signifikant erhöht bzw. die Leptin-Spiegel signifikant reduziert. Dabei waren die Effekte AT2R-spezifisch, denn alle Effekte konnten nicht in den AT2R-KO Mäusen beobachtet werden. Die anti-inflammatorischen Effekte von C21 konnten zudem lokal im Fettgewebe der Mäuse bestätig werden. C21 reduzierte leicht und Valsartan stark den Blutdruck der HFD-Gruppen, während die Effekte in den AT2R-Tieren abgeschwächt waren. Die metabolischen Effekte schienen dabei Blutdruck-unabhängig zu sein, wie durch die Hydralazin- Kontrolle ermittelt werden konnte. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen auf, dass die selektive und direkte AT2R-Stimulation zu anti- inflammatorischen Effekten sowie zu einer positiven Modulation von metabolischen Parametern sowohl im DIO-Modell an Mäusen als auch in entsprechenden in-vitro Experimenten an Adipozyten und Makrophagen führte. Demnach deuten diese Ergebnisse sehr stark darauf hin, dass der AT2R eine wichtige positive metabolische Funktion ausübt und ein mögliches pharmakologisches Ziel für die Behandlung von Adipositas-induzierten Erkrankungen darstellen könnte. Hierfür könnten AT2R-Agonisten in Zukunft eine Therapieoption bieten.

The renin-angiotensin-system (RAS) is one oft the most important regulator of cardiovascular homeostasis and blood pressure in the body. Angiotensin II exerts its effects through two different receptor subtypes: the AT1-receptor (AT1R) and the AT2-receptor (AT2R). The functional role of the AT1R in the development of insulin-resistance (IR) is well understood and it is known that AT1R-blockers (ARBs) improve glucose-intolerance and IR. Some of the ARBs were shown to activate the peroxisome-proliferator-activated-receptor-gamma (PPARgamma) partially, which may explain their anti-inflammatory properties. The metabolic contribution of the AT2R is still not clear and in parts controversial. Thus, this study aimed to determine the functional significance of the AT2R for the development of IR and adipose-tissue inflammation using the first non-peptide AT2R-agonist Compound 21 (C21) in in-vitro cell-models with 3T3-L1 adipocytes and THP-1 macrophages as well as in a diet-induced obesity (DIO) mouse model. AT2R-stimulation with C21 (1 µM) significantly reduced TNF-alpha induced in-vitro inflammation by IL-6 protein-reduction in mature adipocytes. Anti-inflammatory adiponectin protein-expression was strongly reduced in adipocytes by TNF-alpha treatment, but partly restored by co-treatment with C21. These effects were due to specific AT2R-activation, since treatment with the AT2R-antagonist PD123319 (10 µM) abolished the effect of C21. Treatment with C21 also led to a significant reduction of basal pro- inflammatory leptin-production and increased anti-inflammatory IL-10 mRNA- expression in adipocytes. Importantly, C21 (0,1 to 1 µM) did not induce PPARgamma-activity and consequently did not induce adipocyte differentiation. THP-1 macrophages were treated with LPS for in-vitro inflammation. Co- treatment with C21 significantly repressed LPS-induced IL-6 protein. This effect was again abolished by PD123319 treatment. C21 treatment also increased basal IL-10 and decreased LPS-induced MCP-1 mRNA-expression. For the DIO-model wildtype (WT; C57Bl-6) and AT2R-knockout (AT2R-KO) mice were fed with high fat diet (HFD) or control low fat diet (LFD) (60% kcal from fat or 10% kcal from fat, respectively) for 10 weeks to induce obesity and metabolic changes. Afterwards animals (n=10 per group) were treated according to the following protocol for 4 weeks in addition to the diet: The AT2R-agonist C21 (0.3 mg/kg body weight (BW) i.p.), the ARB Valsartan (3 mg/kg BW i.p.), the combination C21 / Valsartan (0.3 / 3 mg/kg BW i.p.), the antihypertensive agent Hydralazine (250 mg/l drinking water) or vehicle. Glucose tolerance (GT) und insulin sensitivity (IS) were measured by standard ITT and GTT tests. GT and IS were impaired by HFD-feeding but significantly improved in mice treated with C21. GT was also improved by Valsartan. Furthermore, TNF-alpha, resistin and serum triglycerides levels were significantly reduced, and serum levels of insulin-sensitizing incretins GLP-1 and GIP were increased by C21-treatment. Consistent with the in-vitro data, C21 treatment increased adiponectin as well as IL-10, and decreased leptin serum levels in a significant manner. Importantly, all effects were not observed in AT2R-KO animals treated with C21 pointing to the AT2R-specificity of these effects. Additionally the anti- inflammatory effects of C21 could be confirmed locally in the adipose-tissue of the mice. C21 slightly and Valsartan strongly lowered blood-pressure in mice of the HFD groups, while these effects were attenuated in the AT2R-KO animals. However, metabolic effects of C21 and Valsartan were blood pressure- independent as controlled for by the Hydralazine treated group. The present study demonstrates that selective and direct AT2R-stimulation results in anti- inflammatory actions as well as positive modulation of metabolic markers in a DIO-model in mice and related in-vitro experiments in adipocytes and macrophages. Thus, these data strongly indicate that the AT2R has an important positive metabolic function suggesting that the AT2R might be a pharmacological target for treatment of obesity-induced metabolic diseases. AT2R-agonists may be a theurapeutic option in the future.